ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tub soldat dúplex per a component químic de la indústria química, la deficiència de SPECC1L condueix a una major estabilitat de les articulacions empalmades i una reducció de l'eliminació de les cèl·lules de la cresta neural cranial.

Gràcies per visitar Nature.com.Esteu utilitzant una versió del navegador amb suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).A més, per garantir un suport permanent, mostrem el lloc sense estils ni JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tub soldat dúplex per a la indústria química

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.és un fabricant líder que està especialitzat en tubs d' acer inoxidable sense soldadura , tubs recuits brillants , tubs enrotllats sense soldadura , etc .Per tal de facilitar als clients , també hem soldat canonades i tubs .Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.té l'equip de producció i prova més avançat.Podem satisfer totalment el vostre requisit .D'acord amb la norma molt estrictament, els tubs produïts per nosaltres sempre tenen una tolerància OD i WT correcta.El control de tolerància és estrictament d'acord per produir estàndards.Els nostres productes sempre estan satisfets amb els clients.Els clients que van comprar els nostres productes van generar més beneficis.
a) OD (diàmetre exterior): 3,18 mm a 101,6 mm
b) WT (gruix de paret): 0,5 mm a 20 mm
c) Longitud: segons el requisit del client
d) Estàndards: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790, etc
e) Mètode de procés: ERW, EFW, etc

Controls lliscants que mostren tres articles per diapositiva.Utilitzeu els botons enrere i següent per moure's per les diapositives, o els botons del controlador de diapositives al final per moure's per cada diapositiva.
Les cèl·lules de la cresta neural cranial (CNCC) es desprenen dels plecs neuronals embrionaris i migren cap als arcs faríngs, que formen la majoria de les estructures mitjanes de la cara.La disfunció del CNCC té un paper important en l'etiologia de la fissura orofacial, una malformació congènita comuna.S'han trobat mutacions heterozigotes SPECC1L en pacients amb escletxes atípiques i sindròmiques.Aquí, informem de la tinció millorada de components d'unió adhesiva canònica (AJ), β-catenina i E-cadherina en cèl·lules de derrota SPECC1L cultivades, i les micrografies electròniques mostren la difusió apical-basal d'AJ.Per entendre el paper de SPECC1L en la morfogènesi craniofacial, vam crear un model de ratolí deficient Specc1l.Els mutants homozigots són letals embrionaris i presenten un tancament deteriorat del tub neural i laminació CNCC.La tinció de proteïna AJ augmenta en els plecs neuronals mutants.Aquest defecte AJ és coherent amb un defecte en la delaminació CNCC, que requereix la dissolució de l'AJ.A més, els mutants Specc11 han reduït la senyalització PI3K-AKT i han augmentat l'apoptosi.In vitro, la inhibició lleu de la senyalització PI3K-AKT a les cèl·lules de tipus salvatge va ser suficient per induir canvis AJ.És important destacar que els canvis d'AJ induïts per la derrota de SPECC1L es poden revertir mitjançant l'activació de la via PI3K-AKT.En conjunt, aquestes dades suggereixen que SPECC1L, com a nou regulador de la senyalització PI3K-AKT i la biologia AJ, és necessari per al tancament del tub neural i l'estratificació CNCC.
Les cèl·lules de la cresta neural cranial (CNCC) es localitzen al neuroectoderm dorsal i es desprenen del neuroepiteli dels plecs neuronals en desenvolupament mitjançant un procés que implica la transició epitelial-mesenquimal (EMT)1,2,3.Els CNCC epitelials premigrants pertorben les unions intercel·lulars i es converteixen en CNCC mesenquimals migratoris que omplen el primer i segon arcs faríngics i formen la major part del cartílag craniofacial.Així, els gens que regulen la funció CNCC sovint es veuen alterats en l'etiologia de les anomalies congènites craniofacials com les escletxes orofacials, que afecten amb més freqüència 1/800 naixements només als EUA.Una de les deformitats congènites8.
La delaminació del CNCC coincideix amb el tancament del tub neural anterior entre 8,5 i 9,5 dies de desenvolupament embrionari en ratolins.Els mutants d'una sèrie de gens associats a la fissura orofacial del ratolí també presenten algun tipus de defecte del tub neural, com ara Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 i Pdgfrα12.Tanmateix, els processos de tancament del tub neural i estratificació CNCC es poden considerar independents, ja que el ratolí mutant Splotch (Pax3) presenta defectes en el tancament del tub neural sense cap efecte sobre l'estratificació o la migració CNCC 13,14.Els models addicionals de ratolí amb defectes en la dissecció CNCC i el tancament del tub neural ajudaran a delimitar la base molecular comuna d'aquests dos processos.
L'aïllament del CNCC de les cèl·lules neuroepitelials requereix la dissolució de les unions adhesives (AJ), que es componen de complexos proteics que contenen, entre d'altres, E-cadherina, β-catenina, α-E-catenina i α-actinina associades amb filaments d'actina 2 Estudis de sobreexpressió E-cadherina en plecs neuronals van mostrar una reducció o retard en la delaminació CNCC.Per contra, la supressió de la E-cadherina dóna lloc a una estratificació primerenca15,16.Molts dels factors que medien l'EMT durant l'estratificació CNCC són factors de transcripció (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) i proteïnes de remodelació de la matriu extracel·lular (ECM), com les metaloproteinases de matriu (MMP), però els CNCC són reguladors directes de l'AJ citoesquelètic. encara no conegut.Se sap que la via PI3K-AKT antagonitza els nivells d'E-cadherina, principalment a partir de la investigació del càncer17.Estudis recents han demostrat que la pèrdua de senyalització PI3K-AKT basada en PDGFα en ratolins condueix a anomalies craniofacials, com ara defectes del paladar hendido i del tub neural12.Tanmateix, la relació entre la via PI3K-AKT i l'estabilitat de l'AJ després de l'estratificació CNCC no està clara.
Prèviament, vam identificar SPECC1L com el primer gen mutant en dues persones amb una fissura severa que s'estén des de la boca fins a l'ull, coneguda com a hendidura obliqua (ObFC) o fissura Tessier IV18.S'han identificat mutacions SPECC1L en dues famílies multigeneracionals amb la síndrome d'Opitz G/BBB autosòmica dominant (OMIM # 145410), en què els individus afectats presentaven hiperdistància i llavi/paladar hendidos19, i en una família amb síndrome de sobredistància Tibi (OMIM # 145420)20 .més de la meitat dels casos de síndrome d'Opitz G/BBB estan lligats a X (OMIM #300000) i són causats per mutacions en el gen MID1, que codifica la proteïna 22 de l'esquelet cel·lular associat als microtúbuls.Presentem la hipòtesi que SPECC1L, també una proteïna associada als microtúbuls i al citoesquelet d'actina, pot mediar la senyalització necessària per a la remodelació del citoesquelet d'actina durant l'adhesió i la migració cel·lular 18 .Mitjançant estudis in vitro i in vivo, ara descrivim SPECC1L com un nou regulador de l'estabilitat de l'AJ mitjançant la senyalització PI3K-AKT.A nivell cel·lular, la deficiència de SPECC1L va provocar una disminució del nivell de la proteïna pan-AKT i un augment de la dispersió apical-basal d'AJ, que es va eliminar mitjançant l'activació química de la via AKT.In vivo, els embrions amb deficiència de Specc11 mostren un tancament deteriorat del tub neural i una dissecció CNCC reduïda.Així, SPECC1L funciona en una senyalització basada en l'adhesió cel·lular altament regulada necessària per a la funció normal de CNCC durant la morfogènesi facial.
Per caracteritzar el paper de SPECC1L a nivell cel·lular, es va utilitzar la línia cel·lular d'osteosarcoma estable descrita anteriorment U2OS deficient a SPECC1L18.Aquestes cèl·lules U2OS estables amb derrocament de SPECC1L (kd) van tenir una disminució moderada (60-70%) dels nivells de transcripcions i proteïnes SPECC1L, juntament amb defectes en la migració i la reorganització del citoesquelet d'actina 18. En canvi, una disminució transitòria severa de S'ha demostrat que SPECC1L condueix a defectes mitòtics 23 .Després d'una caracterització posterior, vam trobar que les nostres cèl·lules estables SPECC1L-kd van canviar la morfologia a un grau de confluència molt alt (figura 1).Les cèl·lules de control individuals i les cèl·lules kd a baixa confluència semblaven similars (figura 1A, D).24 hores després de la fusió, les cèl·lules de control van conservar la seva forma cuboïdal (Fig. 1B, E), mentre que les cèl·lules SPECC1L-kd es van allargar (Fig. 1C, F).L'abast d'aquest canvi en la forma cel·lular es va capturar mitjançant imatges en viu in vivo de cèl·lules de control i cèl·lules kd (pel·lícula 1).Per determinar el paper de SPECC1L a les cèl·lules confluents, primer vam examinar la seva expressió.Vam trobar que els nivells de proteïna SPECC1L van augmentar amb la fusió (figura 1G), mentre que els nivells de transcripció SPECC1L no van augmentar (figura 1H).A més, a mesura que augmentava la densitat cel·lular, la proteïna SPECC1L es va acumular als límits intercel·lulars (Fig. 2A-E), amb un patró que es solapava amb el de la β-catenina associada a la membrana (Fig. 2A'-E').Tenint en compte l'associació de SPECC1L amb el citoesquelet d'actina 18,23, vam plantejar la hipòtesi que SPECC1L interacciona amb les unions adhesives basades en actina (AJ).
(AF) Les cèl·lules de derrota (DF) SPECC1L s'allargan a alta confluència (F) en comparació amb les cèl·lules control U2OS (AC).Aquí es mostren tres dels sis punts de temps (T1, T3, T6) que vam seleccionar per a diferents densitats cel·lulars.(G) Anàlisi de Western blot que mostra que la proteïna SPECC1L està estabilitzada a un alt grau de confluència en comparació amb un baix grau de confluència a les cèl·lules control.Western blot de SPECC1L mostra la banda esperada de 120 kDa i una banda de pes molecular més alt, possiblement modificada posteriorment a la traducció (*).L'anàlisi de Western blot es va realitzar en les mateixes condicions per a la confluència baixa i alta.Les imatges que mostraven SPECC1L a baixa i alta confluència es van prendre de la mateixa taca.La mateixa taca es va eliminar i es va tornar a examinar amb anticossos β-actina.(H) L'anàlisi quantitativa de RT-PCR no va mostrar canvis significatius en els nivells de transcripció SPECC1L.Les barres d'error representen SEM de quatre experiments independents.
(AE) Hem escollit sis punts de temps (T1-T6) que representen una gamma de densitats cel·lulars per normalitzar l'anàlisi de la forma cel·lular i els canvis AJ a les cèl·lules U2OS amb la derrota SPECC1L (kd).Els cinc primers d'aquests punts de temps incloïen cèl·lules individuals (T1), fusió del 50-70% de grups de cèl·lules petites (T2), fusió sense remodelar cèl·lules kd (T3), remodelació de cèl·lules kd (T4) i canvis de 24 hores.en la forma posterior de cèl·lules kd (T5).La proteïna SPECC1L es va dispersar predominantment al citoplasma a T1 (A), però la seva acumulació es va observar als límits intercel·lulars en punts de temps posteriors (B-E, fletxes).(FJ) β-catenina mostra una acumulació similar als límits intercel·lulars associats amb el complex AJ.(A'-E') SPECC1L i β-catenina mostren una tinció superposada a les vores cel·lulars a alta densitat cel·lular (fletxes).(F'-J') A les cèl·lules SPECC1L-kd, la tinció de β-catenina sembla normal a baixa densitat cel·lular (F'-H'), però s'expandeix a mesura que canvia la forma cel·lular (I', J'; fletxes), cosa que indica que AJ ha canviat.Barres = 10 µm.
Aleshores vam intentar determinar l'efecte de la deficiència de SPECC1L sobre AJ.Hem utilitzat diversos marcadors associats a AJ, inclosos els components canònics F-actina, miosina IIb, β-catenina i E-cadherina24,25,26,27.Les fibres d'estrès d'actina van augmentar a les cèl·lules SPECC1L-kd tal com es va descriure anteriorment (Fig. 3A, B) 18 .La miosina IIb associada amb filaments d'actina va mostrar un augment similar de les cèl·lules SPECC1L-kd in vitro (Fig. 3C, D).La β-catenina associada a l'AJ s'uneix a la cadherina a la membrana cel·lular, mostrant un patró d'expressió normal de "bresca" als cubòcits de control (Fig. 3E, G).Curiosament, en imatges planes mitjançant microscòpia confocal, la tinció de β-catenina (Fig. 3E, F) i E-cadherina (Fig. 3G, H) a la membrana cel·lular de cèl·lules confluents amb deficiència de SPECC1L van mostrar patrons destacats de tinció estesa.Aquesta expansió de la tinció de β-catenina associada a AJ a les cèl·lules kd va ser més pronunciada a la confluència, però semblava precedir els canvis en la forma cel·lular (Fig. 2F-J, F'-J').Per determinar la naturalesa física d'aquesta tinció AJ estesa, vam examinar les vores cel·lulars a la superfície apical-basal de les cèl·lules SPECC1L-kd U2OS mitjançant microscòpia electrònica de transmissió (TEM) (figura 3I, J).En contrast amb les cèl·lules de control (Fig. 3I), que tenien regions denses d'electrons separades indicatives d'AJ (fletxes), les cèl·lules kd (Fig. 3J) mostraven regions grans i contigües d'alta densitat d'electrons indicatives d'AJ al llarg del pla apicobasal..A més, en seccions transversals, vam observar extensos plecs de la membrana cel·lular a les cèl·lules kd (Fig. S1A, B), cosa que explica el patró estès de bandes de tinció de β-catenina i E-cadherina (Fig. 3F, H).En suport del paper de SPECC1L en AJ, la β-catenina va ser co-immunoprecipitada amb SPECC1L en lisats de cèl·lules U2OS confluents (Fig. 3K).Juntament amb la immunotinció estesa per als marcadors AJ, l'anàlisi TEM va ser coherent amb la nostra hipòtesi que la deficiència de SPECC1L augmenta la densitat i la variància apical-basal de l'AJ.
(AH) Augment de la tinció d'actina F a les cèl·lules kd a les 48 hores després de la fusió (T6; A, B).Tinció alterada de miosina IIb associada a F-actina (C, D).El patró suau de la tinció de membrana de β-catenina i E-cadherina a les cèl·lules de control (E, G) es va millorar a les cèl·lules SPECC1L-kd (F, H).Barres = 10 µm.(I–J) Micrografies electròniques que observen la unió intercel·lular apical-basal.Les cèl·lules de control mostren regions denses d'electrons diferents que indiquen unions enganxoses (I, fletxes).En canvi, tota la unió apical-basal a les cèl·lules SPECC1L-kd semblava densa d'electrons (J, fletxes), cosa que indica una major densitat i dispersió de les unions adhesives.(K) La β-catenina es va co-immunoprecipitar amb SPECC1L en lisats de cèl·lules U2OS confluents.Imatge presa d'un punt que representa un dels quatre experiments independents.
Per entendre el paper de SPECC1L en la morfogènesi craniofacial, vam crear un model de ratolí deficient Specc1l utilitzant dues línies cel·lulars de trampa ES independents, DTM096 i RRH048 (BayGenomics, CA), que representen l'intró 1 i les transcripcions de Specc1l es van capturar a les 15 (Fig. 1). .4A, figura S2).La ubicació genòmica de la inserció del vector señu es va determinar mitjançant la seqüenciació del genoma sencer i es va confirmar per PCR (Fig. S2).Els dos dissenys de trampes gèniques també van permetre la fusió en el marc dels periodistes Specc11-lacZ després de la captura.Per tant, l'expressió lacZ determinada per la tinció de X-gal es va utilitzar com a indicador de l'expressió Specc11.Tots dos al·lels mostraven patrons d'expressió lacZ similars, amb la trampa del gen DTM096 a l'intró 1 mostrant una expressió més forta que RRH048 a l'intró 15 (no mostrat).Tanmateix, Specc1l s'expressa àmpliament, amb una expressió especialment forta als plecs neuronals a E8.5 (Figura 4B), al tub neural i als processos facials a E9.5 i E10.5 (Figura 4C, D) i a les extremitats en desenvolupament. a E10.5 i els ulls (figura 4D).Abans vam informar que l'expressió SPECC1L al primer arc faríngi a E10.5 estava present a l'epiteli i al mesènquima subjacent18, d'acord amb el llinatge CNCC.Per provar l'expressió SPECC1L a CNCC, vam realitzar plecs neuronals E8.5 (figura 4E-J) i seccions de crani E9.5 (figura 4K-).A E8.5, SPECC1L va tenyir els plecs neurals intensament (Fig. 4E, H), incloses les cèl·lules tacades amb marcadors NCC (Fig. 4G, J).A E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) es va tacar fortament el CNCC en migració co-tacat amb AP2A (Fig. 4L, M) o SOX10 (Fig. 4O, P).
( A ) Representació esquemàtica del gen Specc11 del ratolí que mostra la inserció del vector señuelo als clons de cèl·lules ES DTM096 (intró 1) i RRH048 (intró 15).(BD) tinció lacZ d'embrions heterozigots Specc1lDTM096 que representen l'expressió Specc1l d'E8.5 a E10.5.NE = neuroectoderm, NF = plec neural, PA1 = primer arc faríngi.(EP) Immunotinció SPECC1L amb marcadors NCC AP2A i SOX10 en plecs neuronals E8.5 (NF; EJ) i seccions de crani E9.5 (KP).La tinció SPECC1L es va observar àmpliament als plecs neuronals E8.5 (E, H; puntes de fletxa), incloses les cèl·lules etiquetades amb AP2A (F, G; puntes de fletxa) i SOX10 (I, J; puntes de fletxa).A E9.5, SPECC1L es va tacar fortament els CNCC en migració (K, N; fletxes) etiquetats amb AP2A (L, M; fletxes) i SOX10 (O, P; fletxes).
L'encreuament entre ratolins heterozigots Specc1lDTM096/+ i Specc1lRRH048/+ mostra que els dos al·lels de trampa gènica no són complementaris i que els heterozigots compostos i els homozigots embrionaris per a qualsevol al·lel trampa gènica són embrionaris letals (taula S1).Les proporcions mendelianes van indicar una disminució de la taxa de supervivència dels heterozigots en néixer (s'esperava 1,34 vs. 2,0).Vam observar una baixa mortalitat perinatal entre els heterozigots, alguns tenien anomalies craniofacials (Fig. S3).Tanmateix, la baixa penetració d'aquests fenotips craniofacials perinatals dificulta l'estudi dels seus mecanismes fisiopatològics subjacents.Per tant, ens vam centrar en el fenotip letal embrionari dels mutants Specc11 homozigots.
La majoria dels embrions mutants heterozigots o homozigots compostos Specc1lDTM096/RRH048 no es van desenvolupar després de E9.5–10.5 (Figs. 5A–D), i el tub neural no es tancava anteriorment (Figs. 5B, D) i de vegades es tancava posteriorment (no es mostra). ..Aquest defecte de tancament del tub neural cranial es va associar amb la majoria de DLX2 marcats per CNCC que quedaven als plecs neuronals a E10.5, cosa que indica que no hi ha dissecció (figura 5A'-D').Per determinar si la mida global de CNCC també es va reduir, vam etiquetar les línies CNCC amb GFP a les nostres línies de trampa gènica amb Wnt1-Cre i ROSAmTmG.Transmetem ordenats GFP+ NCC i GFP- (RFP+) no NCC d'embrions sencers.A E9.5, la proporció de CNCC etiquetats amb GFP ordenats per flux no va canviar significativament entre WT i embrions mutants (no mostrats), cosa que indica una especificació CNCC normal.Per tant, vam plantejar la hipòtesi que la tinció residual de Wnt1-Cre i DLX2 als plecs neuronals exposats (figura 5B ') es devia a una capa CNCC defectuosa, possiblement a causa de l'augment de la densitat o la dispersió de les cèl·lules AJ, tal com es veu a les cèl·lules SPECC1L-kd.Hem utilitzat els marcadors NCC SOX10, AP2A i DLX2 per confirmar la presència de CNCC al plec neural (figura 5E-R).A E8.5, es va observar la tinció de plecs neurals per als tres marcadors NCC en seccions de WT (Fig. 5E, G, I) i Specc1l mutant (Fig. 5F, H, J).A E9.5, mentre que els marcadors NCC tenyien NCC en migració a les seccions WT (Fig. 5M, O, Q), es va observar una tinció NCC residual en plecs neuronals exposats d'embrions mutants Specc1l (Fig. 5N, P, R).Com que SOX10 i DLX2 marquen CNCC en migració, aquest resultat suggereix que els CNCC deficients en SPECC1L aconsegueixen l'especificació posterior a la migració, però no poden migrar dels plecs neuronals.
La deficiència de Specc11 condueix a un tancament defectuós del tub neural, delaminació de les cèl·lules de la cresta neural cranial i AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrió que porta cèl·lules de cresta neural cranial en migració (CNCC) etiquetades amb Wnt1-Cre (A').En canvi, els embrions mutants Specc11 mostren plecs neurals oberts (B), puntes de fletxa) i CNCC que no han migrat (B', puntes de fletxa).(C, D') Imatges de camp brillant (C, D') i immunotinció (C', D') del marcador CNCC DLX2 d'embrions E10.5 WT (C, C') i Specc1l (D, D').En els embrions WT E10.5, CNCC positiu DLX2 colonitzen els arcs branquials (C', fletxes), mentre que en els mutants, la tinció conspicua persisteix als plecs neurals oberts (D', fletxes) i als primers arcs faríngs (D', fletxes).) amb algunes tincions (fletxes) que indiquen una mala delaminació i migració de CNCC.ER) Les seccions d'embrions mutants WT i Specc1l a les etapes E8.5 (E-L) i E9.5 (M-R) es van etiquetar amb marcadors NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) i DLX2 (I, J, Q, R).A E8.5, es va observar la tinció de NCC en seccions de plec neural de tipus salvatge (NF) i mutants.La tinció conjunta de SOX10 i β-catenina a E8.5 WT (K) i mutant (L) va revelar un augment de la tinció de β-catenina als límits cel·lulars dels plecs neuronals.A E9.5, es va observar una tinció de tipus salvatge de CNCC en migració (M, O, Q), mentre que en mutants, CNCC no estratificats tenyien plecs neurals oberts (N, P, R).(S–Z) Anàlisi d'etiquetatge AJ in vivo en seccions coronals d'embrions WT i Specc11DTM096/RRH048 amb la mutació E9.5.A la cantonada superior dreta es mostra un pla de secció aproximat.En seccions de teixits mutants, es va observar un augment de la tinció de F-actina (S, T) i miosina IIb (U, V).De manera similar als resultats in vitro de la figura 3, en embrions mutants, es va observar una tinció de membrana millorada per a β-catenina (W, X) i E-cadherina (Y, Z).(AA-BB) Una micrografia electrònica d'una secció d'un embrió de tipus salvatge que mira més enllà de la vora de la cèl·lula apical-basal mostra una regió densa d'electrons diferent indicativa d'unions adhesives (AA, fletxes).En canvi, a les seccions d'embrions mutants Specc11 (BB, fletxes), tota la unió apicobasal és densa d'electrons, cosa que indica una major densitat i dispersió de les unions adhesives.
Per provar la nostra hipòtesi que la reducció de capes es deu a l'AJ alterat, vam examinar l'etiquetatge d'AJ en plecs neuronals exposats d'embrions mutants Specc1l (Fig. 5S-Z).Vam observar un augment de les fibres d'estrès d'actina (Fig. 5S, T) i un augment concomitant de la localització de la tinció de miosina IIB a les fibres d'actina (Fig. 5U, V).És important destacar que vam observar un augment de la tinció de β-catenina (Fig. 5W, X) i E-cadherina (Fig. 5Y, Z) als límits intercel·lulars.També vam examinar la tinció de β-catenina de NCC als plecs neuronals dels embrions E8.5 (Fig. 5K, L).La tinció de β-catenina semblava ser més forta en els plecs neuronals mutants Specc1l (Fig. 5L i K), cosa que suggereix que els canvis AJ havien començat.En micrografies electròniques de seccions de crani d'embrions E9.5, vam tornar a observar un augment de la tinció difusa d'electrons densos en embrions mutants Specc1l en comparació amb WT (Fig. 5AA, BB i S1E-H).En conjunt, aquests resultats donen suport als nostres resultats in vitro en cèl·lules SPECC1L-kd U2OS i suggereixen que la tinció aberrant d'AJ precedeix l'estratificació CNCC en els nostres embrions mutants.
Tenint en compte la relació antagònica coneguda entre l'activitat AKT i l'estabilitat de la cadherina E,17,28 vam plantejar la hipòtesi de la implicació de la senyalització PI3K-AKT.A més, vam observar butllofes subepidèrmiques en alguns dels nostres embrions mutants que van escapar de la letalitat (<5%) a E9.5-10.5 i, en canvi, es van establir al voltant de E13.5 (Fig. S3).Les vesícules subepidèrmiques són un segell distintiu de la senyalització PI3K-AKT reduïda basada en PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) van informar que la interrupció de l'activació de PI3K basada en PDGFRα en embrions mutants PdgfraPI3K/PI3K dóna lloc a vesícules subepidèrmiques, defectes del tub neural i fenotips de paladar hendido.De fet, els nivells de pan-AKT i Ser473-AKT fosforilat actiu es van reduir in vivo en teixits mutants Specc1l fins a l'aturada embrionària E9.5 (Fig. 6A-D).La disminució dels nivells de Ser473-AKT fosforilada pot ser totalment deguda a la disminució dels nivells de pan-AKT in vivo (FIG. 6E) i in vitro (FIG. 6F).Només es va observar una disminució in vitro quan les cèl·lules U2OS eren fortament confluents amb canvis en la forma cel·lular i la densitat d'AJ (figura 6D).Així, les nostres dades suggereixen que SPECC1L és un nou regulador positiu de la senyalització PI3K-AKT en la morfogènesi craniofacial.
(A-E) Seccions de crani E8.5 (A, B) i E9.5 (C, D) o lisats E9.5 d'embrions mutants Specc1l (E) que mostren nivells de reducció de proteïnes S473-AKT fosforilada activa i pan-AKT , en comparació amb el control WT.El Western blotting es va realitzar en lisats de tipus salvatge i lisats mutants en les mateixes condicions.Les imatges mostrades per a SPECC1L es van extreure d'una taca.La mateixa taca es va eliminar i es va tornar a examinar amb anticossos anti-pan-ACT i β-actina.Els nivells de Pan-AKT als plecs neuronals E8.5 (A, B) i els nivells de S473-AKT fosforilat a les seccions de crani E9.5 es van reduir significativament.(F) Els nivells de Pan-AKT es van reduir de manera similar en els lisats de cèl·lules SPECC1L-kd U2OS collides a alta confluència.Les barres d'error representen SEM de tres quantificacions de Western blot independents.(GJ) Seccions d'embrions WT a E9.5 tenyides amb KI67 i caspasa 3 escindida, respectivament, que mostren proliferació cel·lular (G, G') i poca activitat apoptòtica (H, H').Els embrions mutants Specc11 mostren una proliferació cel·lular comparable (I), però el nombre de cèl·lules que pateixen apoptosi augmenta significativament (J).
Després vam examinar els marcadors de proliferació i apoptosi.No vam observar cap diferència en la proliferació d'embrions E9.5 (Fig. 6E, G en comparació amb I) amb un índex de proliferació del 82,5% per als mutants WT i del 86,5% per als mutants Specc1l mesurats per tinció de KI67 (p <0,56, Fisher's). prova exacta).De la mateixa manera, no vam observar cap diferència en l'apoptosi mesurada per la tinció de la caspasa 3 escindida en plecs neuronals a E8.5 fins a la detenció d'embrions (no mostrada) (no mostrada).En canvi, l'apoptosi va augmentar significativament en tots els embrions mutants E9.5 (Fig. 6F, H i J).Aquest augment global de l'apoptosi és coherent amb la reducció de la senyalització PI3K-AKT i la letalitat embrionària precoç29,30,31.
A continuació, per confirmar un paper causal de la senyalització PI3K-AKT en els canvis AJ a les nostres cèl·lules kd, vam alterar químicament la via en les cèl·lules de control i kd (figura 7A-F).Hem utilitzat com a marcador el fenotip de canvi de forma cel·lular observat a les cèl·lules SPECC1L-kd confluents, que hem quantificat utilitzant la proporció de la dimensió més llarga (longitud) i la dimensió vertical corresponent (amplada).S'espera una proporció d'1 per a cèl·lules relativament rodones o cuboïdals (figura 7G).A més de la forma cel·lular, també vam confirmar l'efecte sobre l'AJ mitjançant la tinció de β-catenina (Fig. 7A'-F').La inhibició de la via PI3K-AKT mitjançant wortmannina va ser suficient per canviar la forma cel·lular a les cèl·lules de control (figura 7A, C) i AJ (figura 7A ').L'activador PI3K-AKT SC-79 no va afectar la forma cel·lular (FIG. 7A, E) ni l'expansió AJ (FIG. 7A') a les cèl·lules de control.A les cèl·lules SPECC1L-kd, la supressió addicional de la via PI3K-AKT va donar lloc a un augment de l'apoptosi (Fig. 7B, D) i un augment marcat de la tinció de β-catenina (Fig. 7B'), d'acord amb els nostres mutants pesats in vivo.És important destacar que l'activació de la via PI3K-AKT va millorar significativament la forma cel·lular (figura 7B, F) i els fenotips AJ (figura 7B).Els canvis en la forma de la cèl·lula es van quantificar com a relació de rodonesa cel·lular (CCR) i es van comparar per a la importància tal com es descriu anteriorment (figura 7G).De fet, a les cèl·lules de control (Fig. 7G, CCR = 1,56), el tractament amb wortmannina va ser suficient per alterar significativament la forma de la cèl·lula (Fig. 7G, CCR = 3,61, p <2,4 × 10-9) fins a un grau similar a l'observat. a SPECC1L.-kd cèl·lules (Fig. 7G, CCR = 3,46).El tractament amb wortmannina de cèl·lules SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 3,60, insignificant) no va ser més significatiu que les cèl·lules kd no tractades (Fig. 7G, CCR = 3,46, insignificant) o les cèl·lules de control tractades amb wortmannina (Fig. 7G)., CCR = 3,46, insignificant) també afecta l'allargament cel·lular (7G, CCR = 3,61, insignificant).El més important, l'activador SC-79 AKT va restaurar el fenotip allargat de les cèl·lules SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 1, 74, p < 6, 2 × 10-12).Aquests resultats confirmen que SPECC1L regula la senyalització PI3K-AKT i suggereixen que una disminució moderada de SPECC1L afecta l'adhesió cel·lular, mentre que una forta disminució condueix a l'apoptosi (Fig. 8).
Control (A-F') Cèl·lules de control (A, C, E) i SPECC1L-kd (B, D, F) tractades amb tractament amb inhibidor de la via PI3K-AKT wortmannina (C, D) o activador SC-79 (E, F) .Les cèl·lules de control no tractades són cuboïdals (A) amb una tinció cel·lular normal de β-cat (A'), mentre que les cèl·lules kd són allargades (B) amb una tinció de β-cat augmentada (B').Després de la supressió de la via PI3K-AKT, les cèl·lules de control es van allargar (C) amb l'expansió del gat β (C'), mentre que les cèl·lules kd van començar a patir apoptosi (D), similar als nostres embrions altament mutats i que mostraven un gat β molt millorat.tinció (D').Després de l'activació de la via PI3K-AKT, les cèl·lules de control van romandre cuboïdals (E) i tenien una tinció normal de β-cat (E'), mentre que les cèl·lules kd van mostrar una forma cel·lular significativament millorada (F) i una tinció de β-cat (F'), cosa que indica (G) El grau de canvi de forma de la cel·la a (AF) es va quantificar mitjançant la relació de rodonesa cel·lular (CCR) de la dimensió més llarga (longitud) i la dimensió vertical corresponent (amplada) mitjançant el programari MetaMorph.Les cèl·lules SPECC1L-kd no tractades (NT) (CCR = 3,46) eren significativament més llargues que les cèl·lules control (CCR = 1,56, p <6,1 × 10–13).La inhibició de Wort de la via PI3K-AKT a les cèl·lules de control va ser suficient per provocar un allargament similar en la forma cel·lular (CCR = 3, 61, p <2, 4 × 10-9).De la mateixa manera, l'activació d'AKT per SC-79 a les cèl·lules SPECC1L-kd va restaurar l'allargament cel·lular als nivells de control (CCR = 1, 74, p < 6, 2 × 10–12).El tractament amb wortmannina de cèl·lules SPECC1L-kd va donar lloc a un augment de l'apoptosi, però no va augmentar més el canvi de forma cel·lular (CCR = 3, 60) en comparació amb les cèl·lules de control no tractades (CCR = 3, 46, ns) o tractades amb wortmannina (3, 61) observades a .ns = no importa.Es mostren les mesures de +/- SEM per a 50 cel·les.Les diferències estadístiques es van calcular mitjançant la prova t de Student.
(A) Representació esquemàtica de la inhibició i l'activació de la via PI3K-AKT donant lloc a canvis d'AJ i rescat, respectivament.(B) Model proposat per a l'estabilització de proteïnes AKT per SPECC1L.
Els CNCC premigratoris requereixen la lisi AJ per separar-se de les cèl·lules neuroepitelials del plec neural anterior1,15,32.L'augment de la tinció dels components AJ i la pèrdua de la distribució asimètrica apical-basal de l'AJ en cèl·lules amb deficiència de SPECC1L tant in vitro com in vivo, combinada amb la proximitat física de SPECC1L a β-catenina, suggereix que SPECC1L funciona per mantenir correctament l'estabilitat local de l'AJ músculs organitzatius.citoesquelet d'actina.L'associació de SPECC1L amb el citoesquelet d'actina i la β-catenina i l'augment del nombre de filaments d'actina condensats en absència de SPECC1L és coherent amb l'augment observat de la densitat d'AJ.Una altra possibilitat és que un augment del nombre de fibres d'actina a les cèl·lules amb deficiència de SPECC1L condueixi a un canvi en la tensió intercel·lular.Com que l'estrès cel·lular afecta la dinàmica de l'AJ 33, els canvis de voltatge poden donar lloc a un AJ 34 més difús.Per tant, qualsevol canvi afectarà les capes CNCC.
Wnt1 s'expressa en els primers plecs neuronals que donen lloc a les cèl·lules de la cresta neural.Per tant, el traçat del llinatge Wnt1-cre marca tant el NCC35 anterior com el migratori.Tanmateix, Wnt1 també marca clons de teixit cerebral dorsal també derivats dels plecs neuronals primerencs 35,36, cosa que fa probable que la nostra tinció de mutants E9.5 per als marcadors Wnt1 en plecs neurals oberts no sigui CNCC.La nostra tinció positiva per als marcadors NCC AP2A i SOX10 va confirmar que els plecs neuronals exposats dels embrions mutants Specc11 sí que contenien CNCC.A més, com que AP2A i SOX10 són marcadors de NCC de migració primerenca, la tinció positiva va indicar que aquestes cèl·lules són CNCC postmigratòries que no es poden estratificar per E9.5.
Les nostres dades suggereixen que la regulació molecular d'AJ per SPECC1L està mediada per la senyalització PI3K-AKT.La senyalització AKT es redueix a les cèl·lules i teixits amb deficiència de SPECC1L.Descobriments de Fantauzzo et al.Admet un paper directe per a la senyalització PI3K-AKT en la morfogènesi craniofacial.(2014) van demostrar que la manca d'activació de la senyalització PI3K-AKT basada en PDGFRα condueix a un fenotip de paladar hendido.També mostrem que la inhibició de la via PI3K-AKT és suficient per canviar l'AJ i la forma cel·lular a les cèl·lules U2OS.D'acord amb les nostres troballes, Cain et al.37 va demostrar que la regulació a la baixa de la subunitat PI3K α110 a les cèl·lules endotelials provoca un augment similar de la tinció pericel·lular de β-catenina, anomenada augment de l'"índex de connectivitat".Tanmateix, a les cèl·lules endotelials els filaments d'actina de les quals ja estan molt organitzats, la supressió de la via PI3K-AKT dóna lloc a una forma cel·lular solta.En canvi, les cèl·lules SPECC1L-kd U2OS mostraven una forma cel·lular allargada.Aquesta diferència pot ser específica del tipus de cèl·lula.Tot i que la supressió de la senyalització PI3K-AKT afecta permanentment el citoesquelet d'actina, l'efecte sobre la forma cel·lular està determinat pels canvis de tensió causats pels canvis en la densitat i l'organització de les fibres centrals d'actina.A les cèl·lules U2OS, només vam utilitzar els canvis de forma cel·lular com a marcador del canvi i la recuperació d'AJ amb deficiència de SPECC1L.En conclusió, hipotetitzem que la inhibició de la via AKT en la deficiència de SPECC1L augmenta l'estabilitat de l'AJ i redueix la delaminació en CNCC.
Curiosament, els nivells de pan-AKT es van reduir in vitro i in vivo a més dels nivells de 473-AKT fosforilats en absència de SPECC1L, cosa que suggereix la regulació de la senyalització PI3K-AKT a nivell d'estabilitat o rotació de proteïnes AKT.Els gens SPECC1L i MID1, tots dos associats a la síndrome d'Opitz/GBBB, codifiquen proteïnes que estabilitzen els microtúbuls 18,22.El mecanisme pel qual SPECC1L i MID1 medien l'estabilització dels microtúbuls no s'entén del tot.En el cas de SPECC1L, aquesta estabilització inclou una acetilació millorada d'un subconjunt de microtúbuls 18 .És possible que SPECC1L utilitzi un mecanisme similar per estabilitzar altres proteïnes com l'AKT.S'ha demostrat que l'acetilació de residus de lisina a la proteïna AKT condueix a una disminució de la localització de la membrana i la fosforilació38.A més, es requereix la ubiqüitinació de la cadena K63 al mateix residu de lisina a l'AKT per a la seva localització i activació de membrana39,40.Entre diversos factors que interactuen amb les proteïnes SPECC1L identificades en diverses pantalles de dos híbrids de llevat d'alt rendiment, quatre - CCDC841, ECM2942, APC i UBE2I43 - s'han implicat en la rotació o l'estabilitat de proteïnes mitjançant la ubiquitinació o la sumoilació.SPECC1L pot estar implicat en la modificació post-traduccional dels residus de lisina AKT, afectant l'estabilitat de l'AKT.Tanmateix, el paper crític de SPECC1L en la localització i estabilitat de la proteïna AKT encara està per dilucidar.
Els defectes greus en l'expressió SPECC1L in vivo van donar lloc a un augment de la tinció del marcador AJ i una superposició defectuosa de CNCC, així com un augment de l'apoptosi i la letalitat embrionària primerenca.Informes anteriors han demostrat que els mutants de ratolí amb nivells augmentats d'apoptosi estan associats amb defectes del tub neural 44,45,46,47 i defectes craniofacials48.S'ha suggerit que la mort cel·lular excessiva als plecs neuronals o als arcs faríngs pot donar lloc a un nombre insuficient de cèl·lules necessàries per al moviment morfogenètic adequat 48,49,50.En canvi, les nostres línies cel·lulars deficients en SPECC1L amb una expressió SPECC1L moderadament reduïda només van mostrar canvis d'AJ sense evidència d'augment de la mort cel·lular.Tanmateix, la inhibició química de la via PI3K-AKT en aquestes cèl·lules Kd va provocar un augment de l'apoptosi.Així, una disminució moderada de l'expressió o funció de SPECC1L garanteix la supervivència cel·lular.Això és coherent amb l'observació que els embrions mutants Specc11 rars que escapen de l'arrest a st.E9.5, potser a causa de la reducció de l'eficiència de captura de gens, són capaços de tancar els seus tubs neurals i aturar-se més tard en el desenvolupament, sovint amb defectes craniofacials (Fig. S3).També és coherent amb això la rara aparició d'embrions Specc1l heterozigots amb anomalies craniofacials, probablement a causa de l'augment de l'eficiència de la captura de gens, així com la troballa en el peix zebra en què un dels dos ortòlegs SPECC1L (specc1lb) provoca fenotips embrionaris tardans, inclosa la pèrdua de maxil·lars inferiors i esquerdes bilaterals51.Així, les mutacions heterozigotes de pèrdua de funció SPECC1L identificades en pacients humans poden causar petites alteracions en la funció SPECC1L durant la morfogènesi craniofacial, suficients per explicar les seves escletxes orofacials.La regulació dels contactes intercel·lulars basada en SPECC1L també pot tenir un paper en la palatogènesi i la fusió dels arcs faríngs.Estudis addicionals de la funció SPECC1L ajudaran a dilucidar el paper dels contactes intercel·lulars temporals en CNCC durant el tancament del tub neural en la motilitat de les cèl·lules neuroepitelials i la morfogènesi craniofacial.
El control de l'osteosarcom U2OS i les cèl·lules SPECC1L-kd s'han descrit anteriorment (Saadi et al., 2011).Els anticossos contra SPECC1L també s'han caracteritzat prèviament (Saadi et al., 2011).Anticossos anti-β-catenina (conill; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (ratolí; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miosina IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherina (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Califòrnia), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), caspasa escindida 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) i β-actina (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) es va utilitzar tal com es descriu..Els filaments d'actina es van tenyir amb rodamina falloidina Acti-stain (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Les cèl·lules de control U2OS i les cèl·lules SPECC1L-kd es van cultivar en DMEM estàndard d'alta glucosa complementat amb sèrum boví fetal al 10% (Life Technologies, Carlsbad, CA).Per als canvis d'AJ, es van sembrar 2 x 105 cèl·lules sobre vidre tractat amb gelatina porcina al 0, 1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i es van observar canvis en la forma cel·lular.Les cèl·lules es van recollir en diferents moments indicats: 4 hores després de la sembra (t = 1), 24 hores després de la sembra (t = 2), confluència sense canvi en la forma cel·lular (t = 3), canvi en la forma cel·lular (t = 4) , 24 h després del canvi de forma cel·lular (t = 5) i 48 h després del canvi de forma cel·lular (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Per modular la via PI3K-AKT, es van cultivar cèl·lules a les concentracions indicades amb l'inhibidor de PI3K-AKT wortmannina (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) o activador SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).El medi que contenia els productes químics es canviava diàriament.
Es van fer enregistraments fotograma a fotograma amb control en directe i cèl·lules KD en condicions de cultiu normals, i es van recollir imatges de contrast de fase cada 10 minuts durant 7 dies.Les imatges es van adquirir mitjançant un microscopi invertit Leica DM IRB controlat per ordinador equipat amb un escenari mecànic i un objectiu N-PLAN de 10 × connectat a una càmera QImaging Retiga-SRV.Durant la imatge, els cultius cel·lulars es van mantenir a 37 ° C en una atmosfera humida amb un 5% de CO2.
Es van utilitzar dues línies cel·lulars ES de trampa genètica DTM096 i RRH048 del Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) per generar línies de ratolí deficients en Specc11, designades Specc1lgtDTM096 i Specc1lgtRRH046.Breument, es van injectar cèl·lules 129/REJ ES en blastocists C57BL6.Els ratolins mascles quimèrics resultants es van criar amb ratolins femelles C57BL6 per identificar la descendència amb la coloració de la capa agouti.La presència d'insercions de vectors de trampa gènica es va utilitzar per identificar heterozigots.Els ratolins es van mantenir en un fons mixt de 129/REJ; C57BL6.La ubicació del lloc d'inserció del vector trampa genètica es va confirmar mitjançant RT-PCR, seqüenciació del genoma i complementació genètica (figura suplementària 1).Per rastrejar el llinatge CNCC de ratolins Specc1lGT dobles heterozigots, es van creuar ratolins ROSAmTmG (#007576) i Wnt1-Cre (#003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) per produir l'al·lel ROSAmTmG i Wnt1-Cre al mutant Speccry1l.Tots els experiments amb ratolins es van realitzar segons protocols aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals del Centre Mèdic de la Universitat de Kansas.
Els embrions es van fixar en (1% de formaldehid, 0,2% de glutaraldehid, 2 mM de MgCl2, 0,02% de NP-40, 5 mM EGTA) durant 60 min a temperatura ambient.Després de la fixació en solució de tinció X-gal (ferricianur de potassi 5 mM, ferrocianur de potassi 5 mM, MgCl2 2 mM, desoxicolat de sodi al 0,01%, NP-40 al 0,02%, X-gal 1 mg/ml) el desenvolupament de la taca es va realitzar a 37 °C. .°C en 1-6 hores.Els embrions es van fixar posteriorment en un 4% de PFA i es van visualitzar.
Per a Western blotting, les cèl·lules es van lisar en tampó de lisi passiu (Promega, Fitchburg, WI) complementat amb una barreja d'inhibidors de la proteasa HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Els lisats es van processar en gels preparats Mini-PROTEAN TGX de poliacrilamida al 12% (Bio-Rad, Hercules, CA) i es van transferir a membranes Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Les membranes es van bloquejar en llet al 5% en PBS que contenia 0, 1% de Tween.Els anticossos es van incubar durant la nit a 4 ° C o durant una hora a temperatura ambient.Es va utilitzar el reactiu Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) per a la generació de senyals.Per a la immunocoloració, els embrions es van fixar durant la nit en un 4% de PFA/PBS i es van criopreservar.Les crioseccions de teixit es van bloquejar en PBS que contenia un 1% de sèrum de cabra normal (Thermo Scientific, Waltham, MA) i un 0, 1% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i després es van incubar a 4 ° C en una incubadora durant la nit.amb anticòs i anticossos secundaris fluorescents (1:1000) durant 1 hora a 4 °C.Les seccions tacades es van col·locar en un medi d'or ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) i es van obtenir imatges planes mitjançant un microscopi confocal Leica TCS SPE.Cada immunotinció es va realitzar com a tres experiments independents en cirosseccions d'almenys dos embrions mutants.Es mostra un experiment representatiu.
Les cèl·lules es van incubar en tampó RIPA modificat (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glicerol, 2 mM EDTA i inhibidor de la proteasa HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Breument, els lisats es van purificar prèviament amb perles magnètiques de proteïna G (Life Technologies, Carlsbad, CA) i després es van incubar durant la nit a 4 ° C. Es van utilitzar perles de proteïna G anti-SPECC1L o IgG per extreure SPECC1L i es va realitzar Western blotting mitjançant l'anti Anticòs -β-catenina descrit anteriorment Els experiments de co-IP mostrats són representatius de quatre experiments independents.
Es van proporcionar cèl·lules de cultiu fixes o teixits embrionaris de ratolí al centre de microscòpia electrònica del Centre Mèdic de la Universitat de Kansas.Breument, les mostres es van incrustar a la resina EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), es van polimeritzar durant la nit a 60 ° C i es van seccionar a 80 nm mitjançant un ultramicròtom Leica UC7 equipat amb una fulla de diamant.Les seccions es van visualitzar mitjançant un microscopi electrònic de transmissió JEOL JEM-1400 equipat amb una pistola Lab6 de 100 kV.
Com citar aquest article: Wilson, NR et al.La deficiència de SPECC1L condueix a una major estabilitat de les articulacions empalmades i a una reducció de la delaminació de les cèl·lules de la cresta neural cranial.la ciència.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Inducció i diferenciació de la cresta neural.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Cèl·lules de la cresta neural cranial en moviment: el seu paper en el desenvolupament craniofacial.American Journal of Medical Genetics.Part A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: el seu creixement i desenvolupament al llarg de 20 anys.Pediatra.patologia.laboratori.medicament.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU i Noten MM Avenç en la genètica de les esquerdes orofacials.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. i Riley, FM Mecanismes moleculars de la migració i el modelatge de cèl·lules de la cresta neural cranial durant el desenvolupament craniofacial.Desenvolupament 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH i Murray, JK Llavi i paladar hendidos: entendre les influències genètiques i ambientals.comentari natural.Genètica 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Morfogènesi anormal de la pell, les extremitats i la regió craniofacial en ratolins amb deficiència de factor 6 (Irf6) que regula l'interferó.Genette Nacional.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Les mutacions dominants en GRHL3 causen la síndrome de van der Waord i perjudiquen el desenvolupament del periderme oral.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ i Juriloff, DM Actualitzeu la llista de mutants de ratolí amb defectes en el tancament del tub neural i avança cap a una comprensió genètica completa del tancament del tub neural.Investigació de defectes de naixement.Part A, Teratologia clínica i molecular 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA i Soriano, P. La senyalització PDGFRalpha mediada per PI3K regula la supervivència i la proliferació en el desenvolupament de l'esquelet mitjançant una via intracel·lular dependent de p53.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND i Murdoch, JN Disheveled: Relació de l'expansió convergent amb el tancament del tub neural.Tendències en neurologia.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).