Component químic de tubs enrotllats d'acer inoxidable 347, identificació de noves proteïnes de chaperona antigen de leucòcits humans sensibles a interferó-A (HLA-A) mitjançant espectrometria de masses reticulada (CLMS)

Gràcies per visitar Nature.com.Esteu utilitzant una versió del navegador amb suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).A més, per garantir un suport permanent, mostrem el lloc sense estils ni JavaScript.
Controls lliscants que mostren tres articles per diapositiva.Utilitzeu els botons enrere i següent per moure's per les diapositives, o els botons del controlador de diapositives al final per moure's per cada diapositiva.

Descripció del producte

Tubs de bobina d'acer inoxidable 347L, grau d'acer: SS347L

El sistema de senyalització d'interferó indueix una forta resposta de citocines a una àmplia gamma de senyals patògens i patològics intrínsecs del medi ambient, donant lloc a la inducció de subconjunts de proteïnes induïbles per interferó.Hem aplicat l'espectrometria de masses d'enllaç creuat (CLMS) mediada per DSS per detectar noves interaccions proteïna-proteïna en el domini de les proteïnes induïdes per interferó.A més de les esperades proteïnes induïbles per interferó, també vam identificar nous aductes reticulats intermoleculars i intramoleculars de proteïnes canòniques inducibles per interferó com MX1, USP18, OAS3 i STAT1.Ens vam centrar en la validació ortogonal d'un nou conjunt de xarxes de proteïnes induïbles per interferó formades per proteïnes HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) mitjançant co-immunoprecipitació i el seu estudi posterior mitjançant modelització de dinàmica molecular.La modelització de la dinàmica conformacional del complex proteic va revelar diversos llocs d'interacció que reflectien les interaccions identificades a les troballes de CLMS.Junts, presentem un estudi pilot de CLMS per identificar nous complexos de senyalització induïts per interferó i esperem l'ús més ampli de CLMS per identificar noves dinàmiques d'interaccions de proteïnes en el microambient tumoral.
Abans que comenci una resposta immune adaptativa, el sistema de defensa innat de l'hoste munta una resposta antimicrobiana mediada per una família de citocines alfa-helicoïdals secretades anomenades interferons (IFN).Les classes d'IFN de tipus I IFNα i IFNβ activen respostes cel·lulars, incloent estats antivirals, proapoptòtics, proinflamatoris i antiproliferatius.En humans, es coneixen 13 subtipus d'IFNα, tots agrupats al cromosoma 91. Sorprenentment, només s'ha estudiat l'IFNα2 per a ús clínic.Recentment, s'ha prestat especial atenció a la investigació sobre altres subtipus d'IFNα.Un estudi recent va demostrar que IFNα14 és una de les isoformes més efectives per restringir la replicació de HBV2 i VIH-13,4 en comparació amb el subtipus canònic IFNα2.
S'ha establert que els complexos de receptors d'interferó de tipus I activats (IFNAR1 i IFNAR2) desencadenen una cascada de transducció de senyal mediada per les quinases Janus TYK2 i JAK15,6.Aquestes Janus quinases fosforilen transductors de senyal i activadors de proteïnes transcripcionals (STAT1 i STAT2) sobre residus de tirosina per iniciar l'heterodimerització mediada pel domini SH26.Posteriorment, IRF9 uneix heterodímers STAT per formar un complex trimèric del gen del factor 3 estimulat per IFN (ISGF3), que es transloca al nucli i indueix la transcripció de més de 2000 gens estimulats per interferó (ISG)5,6,7,8.
Els ISG formen la columna vertebral del sistema immunitari innat, especialment en resposta a un atac viral.Com a primera línia de defensa contra la infecció viral, les cèl·lules despleguen ràpidament interaccions extenses de proteïnes cel·lulars amb una àmplia gamma d'activitats biològiques.Aquestes proteïnes inclouen receptors de reconeixement de patrons, molècules de senyalització, factors de transcripció i proteïnes amb funcions antivirals directes, així com reguladors negatius de les respostes immunitàries9.Gran part de la informació sobre l'activitat de l'ISG prové de pantalles funcionals que utilitzen pantalles de sobreexpressió10,11 o tècniques de silenciament gènic (siRNA, RNAi i CRISPR)12,13 en què els ISG individuals s'expressen o s'inhibeixen i la seva activitat es prova en diversos virus.Tot i que aquests estudis han determinat les propietats antivirals dels ISG individuals, els mecanismes moleculars subjacents de cada ISG segueixen sent molt desconeguts.En general, s'accepta que moltes proteïnes interaccionen amb una o més citocines per assegurar una activitat completa, de manera que els ISG interaccionen directament o les seves interaccions estan mediades per proteïnes cel·lulars.Per exemple, un recent estudi de proteòmica fotoreticulada va identificar l'ATPasa VCP/p97 com un important soci d'interacció IFITM3, la inhibició del qual condueix a defectes en l'ordenació lisosomal, la rotació i el cotransport d'IFITM3 amb partícules virals 14 .Mitjançant la immunoprecipitació, vam identificar VAPA, una proteïna associada a vesícules, com a soci d'interacció amb IFITM1/2/3 que media la maduració viral mediada pel colesterol, i això va ser confirmat per un altre estudi que utilitzava un sistema de dos híbrids de llevats.Suport científic 15 , 16 .
Un procés biològic fonamental implicat en la supressió de la infecció i la transformació maligna és la presentació d'antigen, que està mediada per molècules del complex major d'histocompatibilitat (MHC).Els pèptids (de 8 a 12 aminoàcids de llarg) de proteïnes escindides, acabades prematurament o plegades malament es carreguen a l'heterodímer MHC-I (constituït per cadenes pesades i lleugeres de MHC-I, anomenades β-2-microglobulina; β2M) 17,18.Els trímers MHC-I estables resultants es transporten a la superfície cel·lular, on presenten pèptids intracel·lulars a les cèl·lules T CD8+ (cèl·lules T citotòxiques)17.Les cèl·lules T reconeixen i destrueixen aquests patògens i cèl·lules que porten un antigen específic del tumor.En conseqüència, els patògens i les cèl·lules tumorals sovint suprimeixen el procés de presentació d'antigen per evitar la vigilància immune.A més, el MHC-I està regulat a la baixa en el 40-90% dels tumors humans i sovint s'associa amb un pronòstic més dolent19.
Els gens implicats en la resposta als patògens han de canviar ràpidament entre un estat de repòs i un estat de transcripció activa.Per tant, es planteja la hipòtesi que diverses proteïnes cel·lulars estan implicades en la resposta a una alta demanda d'IFN durant períodes curts de temps, inclosa la remodelació i la modificació de la cromatina promotora 20,21.La majoria dels estudis s'han centrat en la identificació de socis proteics ISG individuals en presència d'IFN.Diversos estudis proteòmics i transcriptòmics en sistemes cel·lulars model han dilucidat l'efecte de l'IFN en el paisatge cel·lular.Tanmateix, malgrat una comprensió creixent de la dinàmica induïda pels interferons, encara sabem poc sobre la implicació dels ISG.Quan es considera la complexitat i la dinàmica depenent del temps de la senyalització d'interferons, sorgeixen dues qüestions: (i) és possible estabilitzar i atrapar els complexos multiproteics implicats en la senyalització ràpida i (ii) es poden mapejar aquestes interaccions a l'espai 3D?
Per abordar aquests problemes, vam implementar la reticulació química mediada per subrat de disuccinimida (DSS) juntament amb espectrometria de masses (CLMS) per estudiar la xarxa d'interacció de proteïnes induïda per IFNα i la seva dinàmica.DSS afegeix enllaços covalents entre residus proximals de proteïnes i/o complexos proteics in vivo.L'anàlisi posterior de l'EM revela llocs d'enllaç específics que reflecteixen la proximitat espacial de regions dins d'una proteïna particular, anomenades enllaços interns, o subunitats en complexos proteics, anomenades interrelacions.Mitjançant aquest enfocament, hem identificat diversos complexos proteïna-proteïna nous, així com xarxes d'interacció multiproteïna induïdes per interferó.En provar més un subconjunt d'aquestes noves interaccions, demostrem que H2BFS (FS de tipus histona H2B; d'ara endavant denominat H2B) i MDN1 actuen com a socis vinculants per a HLA-A.
Les cèl·lules Flo-1 són un dels models in vitro més coneguts d'adenocarcinoma esofàgic, ja que imiten les característiques clau dels tumors d'esòfag22,23.Tanmateix, no tots els tumors són immunogènics i per determinar si les cèl·lules Flo-1 responen al tractament amb interferó, vam tractar cèl·lules Flo-1 amb 10 ng/ml d'IFNα durant 72 hores.Les cèl·lules Flo-1 van mostrar una inducció primerenca de pSTAT1 i IRF1, començant 2 hores després del tractament i continuant durant 72 hores, amb una disminució depenent del temps dels nivells estacionaris d'IRF1 (figura 1A).Es va trobar que els ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 i ISG15) estaven fortament induïts després de 6 hores, imitant les clàssiques respostes de fase mitjana i tardana a IFNα (figura 1A).En conjunt, aquestes dades suggereixen que aquest model cel·lular es pot utilitzar per estudiar les respostes d'interferó.
Respostes d'expressió de proteïnes diferencials a les cèl·lules Flo-1 després del tractament amb IFNα.(A) L'expressió de proteïnes a les cèl·lules Flo-1 tractades amb 10 ng/ml d'IFNα durant 2, 6, 24, 48 i 72 hores es va analitzar mitjançant immunoblot mitjançant els anticossos ISG indicats.(B) Gels SDS-PAGE tenyits de blau de Coomassie d'extractes de cèl·lules senceres després de la reticulació amb DSS durant els temps i concentracions indicats.(C) Immunoblot representatiu examinat amb anticòs p53 (DO-1) de les mateixes mostres per avaluar el grau de reticulació de proteïnes.
Per capturar el paisatge d'interacció de proteïnes in situ, hem utilitzat DSS, un agent de reticulació àmpliament utilitzat a causa de la seva alta permeabilitat de la membrana i el seu temps de reacció relativament curt.El temps de reacció més curt ajuda a prevenir la formació de grans agregats de proteïnes reticuladas, mantenint així l'estabilitat del reticulant.Per determinar la concentració òptima de DSS i evitar la reticulació excessiva, primer vam exposar les cèl·lules a 5, 2,5 i 1 mM de DSS durant 5, 10, 5 i 30 minuts, respectivament, i vam analitzar els lisats mitjançant SDS-PAGE tenyit amb Coomassie. (dades no mostrades).Els lisats cel·lulars semblen estar molt reticulats a la concentració més baixa i al punt de temps més curt.Per tant, el DSS es va valorar a 1, 0, 5 i 0, 1 mM durant 5 minuts (figura 1B).Es va observar una reticulació òptima amb DSS 0, 5 mM durant 5 minuts i es van triar aquestes condicions per a cèl·lules tractades amb IFNα.A més, la figura 1C mostra un Western blot realitzat mitjançant l'anticòs p53 (DO-1) per avaluar el grau de reticulació de proteïnes.
Les cèl·lules Flo-1 es van tractar amb 10 ng/ml d'IFNα durant 24 hores abans d'afegir el reticulant.Les cèl·lules entrecreuades van ser posteriorment lisades mitjançant proteòlisi en dos passos i les proteïnes van ser processades per FASP (Fig. 2)24,25.Els pèptids tríptics reticulats es van analitzar mitjançant espectrometria de masses (Fig. 2).A continuació, els espectres MS/MS es combinen amb la seqüència de proteïnes i es quantifiquen amb MaxQuant26,27.Els pèptids reticulats es van identificar a partir dels espectres obtinguts mitjançant el programa SIM-XL, i els compostos individuals es van combinar en una xarxa complexa mitjançant les canonades de programari informàtic de codi obert xQuest28 i SIM-XL29 (Fig. 2).SIM-XL identifica interaccions proteïna-proteïna, cadenes internes i cadenes individuals en mescles de proteïnes simples o complexes i proporciona scripts per visualitzar les interaccions en estructures de proteïnes.A més, classifica cada referència creuada com a puntuació d'identificació segons la qualitat de l'espectre MS/MS29.S'han identificat diverses interaccions i complexos proteïna-proteïna altament fiables, i s'ha investigat més un nou conjunt d'interaccions mitjançant la co-immunoprecipitació i els canvis conformacionals de complexos mitjançant modelització de dinàmica molecular (MD) (Fig. 2) 30, 31.
Visió general esquemàtica del mètode CLMS.Les cèl·lules Flo-1 es van tractar amb 10 ng/ml d'IFNα durant 24 hores seguits de la reticulació de proteïnes in situ mitjançant DSS seguit de la lisi cel·lular i la tripsinització.Les mostres enllaçades es van analitzar mitjançant un espectròmetre de masses Orbitrap i es van mostrejar més per a la fragmentació dels precursors de pèptids durant LC-MS/MS.Es van identificar dos pèptids enllaçats a partir dels espectres obtinguts mitjançant la màquina de reconeixement d'espectres del programa Crosslinked Peptides (SIM-XL) i tots els compostos es van combinar en una xarxa complexa mitjançant canonades computacionals.Filtreu les interaccions de baixa confiança basades en puntuacions de taxa de falsos positius (FDR).Es van confirmar encara més diverses interaccions proteïnes-proteïnes d'alta fidelitat mitjançant la coimmunoprecipitació i es van examinar els canvis conformacionals dels complexos mitjançant el modelatge de dinàmica molecular (MD).
Es van detectar un total de ~ 30.500 i ~ 28.500 pèptids mitjançant MaxQuant en mostres d'IFNα no estimulades i estimulades, respectivament (taula suplementària S1, figura 3A).La distribució de la longitud del pèptid en ambdós casos va mostrar una proporció més gran de pèptids més grans, cosa que indica la presència de pèptids reticulats (Fig. 3B, C).A més, una proporció més gran de pèptids més grans estaven presents en el rang 40-55 en mostres tractades amb IFNα (Fig. 3C).El mapatge de proteïnes contra la intensitat log2 va mostrar que les proteïnes clàssiques estimulades per interferó eren les més abundants en comparació amb les mostres no tractades, incloses MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 i HLA-F (figura 3D).L'anàlisi de les vies de proteïnes enriquides més de tres vegades en resposta al tractament amb IFNα mitjançant la base de dades de la via Reactome va demostrar que la presentació i processament d'antigen mediat per MHC-I era la via més dominant (figura 3E).D'acord amb els informes anteriors, les respostes antivirals mediades per l'OEA i l'ISG15, així com la senyalització d'IFNα/β i de citocines es trobaven entre les vies activades.A més, es van identificar enllaços creuats de proteïnes específiques de lisina i serina a partir dels espectres MS/MS adquirits originalment mitjançant SIM-XL.Un estudi recent va informar de 104 ISG que abasten 20 virus de 9 classes de virus mitjançant una metaanàlisi d'estudis de sobreexpressió ISG individuals en 5 tipus de cèl·lules9.Tanmateix, per superar les limitacions computacionals del cribratge de grans conjunts de dades, vam començar amb un conjunt de dades més petit per explorar possibles interaccions entre la llista de gens IRDS informats per Padaria et al., la majoria dels quals són ISG.
Identificació de proteïnes entrecreuades expressades de manera diferencial en resposta a IFNα (dades obtingudes de MaxQuant).(A) Diagrama de Venn que representa el nombre de pèptids comuns i exclusius identificats en mostres Flo-1 tractades i no tractades amb IFNα14.Distribució de la longitud del pèptid de mostres reticulates no tractades (B) i tractades amb IFNα (C).( D ) Mapa de calor que representa log2 (intensitat LFQ) entre cèl·lules Flo-1 no tractades i tractades amb IFNα14.El panell esquerre mostra les proteïnes activades més activament en presència d'IFNα.(E) Histograma que representa les 20 vies d'enriquiment principals després del tractament amb IFNα.La base de dades de la via Reactome va analitzar canvis més de quatre vegades en les proteïnes que responen a IFNα regulades.
L'estimulació ISG mediada per interferó està ben documentada, però a nivell molecular no s'entén poc com aquestes proteïnes culminen en una àmplia gamma de funcions biològiques.Hem investigat les interaccions de proteïnes amb un alt grau de confiança entre els ISG coneguts.Curiosament, vam identificar una xarxa que inclou proteïnes MX1, USP18, ROBO1, OAS3 i STAT1 que formen un gran complex en resposta al tractament amb IFNα (figura 4, taula S2) 32,33,34.El més important és que aquestes interaccions es van trobar en tots els triplicats tractats amb IFNα i no es van trobar en mostres no tractades, cosa que suggereix que es van formar específicament en resposta al tractament amb IFNα.Se sap que STAT1 regula transcripcionalment l'expressió d'aquests ISG, però no s'ha estudiat la seva interacció amb els ISG a nivell proteic.L'estructura cristal·lina de STAT1 va demostrar que el seu domini helicoïdal (CCD) no està implicat en la interacció amb l'ADN o els protòmers durant la formació de dímers35.Aquestes hèlixs α formen una estructura d'hèlix helicoïdal que proporciona una superfície predominantment hidròfila perquè es produeixin interaccions 35 .A les nostres dades de CLMS, vam observar que la majoria de les interaccions amb STAT1 es van produir al domini SH2 anterior al CCD, al domini de l'enllaç o a la cua C-terminal (residus 700-708) (figura 4A).Un estudi anterior va informar que USP18 s'uneix al domini d'unió a l'ADN i CCD (DBD) de STAT2 i es recluta a la subunitat del receptor d'interferó de tipus I IFNAR2 per mediar la inhibició de la senyalització d'interferó de tipus I 24 .Les nostres dades també van mostrar que el domini catalític USP18 interacciona amb STAT1 DBD (figura 4A, D), cosa que suggereix que tant STAT1 com STAT2 poden tenir un paper en l'atracció d'USP18 a IFNAR2.
Xarxa ISG proteïna-proteïna identificada en cèl·lules entrecreuades tractades amb IFNα.(A) Gràfic d'interacció en 2D que mostra les interaccions proteïna-proteïna (generades al programa SIM-XL), amb línies que representen interaccions intermoleculars (tall de reticulació establert a 3,5).Els dominis de diferents identitats estan marcats pel seu color32: domini MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) i GED (569–660).Dominis OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) i OAS1_C (903-108).Domini ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) i fn3 (777–864).Camps STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) i STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Visor circular de proteïnes entrecreuades (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 i STAT1) amb interaccions i interaccions marcades en blau i vermell, respectivament.El llindar d'enllaç creuat es va establir en 3,5.Els gràfics de punts indiquen llocs d'interacció STAT1 amb MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) i OAS3 (F), així com llocs d'interacció K o S entre els dos pèptids.A la figura, el llindar de puntuació d'enllaç creuat s'estableix en 3,0.(G) Diversos llocs d'interacció entre els dominis DI STAT1 i OAS3 superposats a les seves estructures de proteïnes a PyMol (sistema de gràfics moleculars PyMOL, versió 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (id pdb: 1bf533) i OAS3 (id pdb: 4s3n34).) programa.
S'han descrit dues isoformes d'USP18 en humans, una proteïna de longitud completa que es troba predominantment al nucli, i una isoforma sense domini N-terminal, USP18-sf, que es distribueix uniformement al citoplasma i al nucli 36 .A més, es va predir que l'extrem N-terminal no estava estructurat i no requereix activitat isopeptidasa ni unió a ISG1537.La majoria de les interaccions identificades al nostre estudi es van localitzar a l'extrem N de la proteïna, cosa que suggereix que aquestes interaccions impliquen USP18 de longitud completa (figura 4A, D) i, per tant, probablement es produeixen al nucli.A més, les nostres dades també indiquen que l'extrem N-terminal està especialitzat en interaccions proteïna-proteïna.El lloc d'unió d'IFNAR2 es troba entre els residus 312-368 i, sobretot, cap de les proteïnes del complex s'uneix a aquesta regió (Fig. 4A) 37,38.Aquestes dades en conjunt indiquen que el domini d'unió IFNAR2 l'utilitza exclusivament la proteïna receptora.A més, es va trobar que només OAS3 i ROBO1 estaven associats amb dominis aigües amunt de l'extrem N-terminal i el lloc d'unió d'IFNAR2 (figura 4A).
ROBO1 pertany a la superfamília de les immunoglobulines (Ig) de molècules de senyalització transmembrana i consta de cinc dominis Ig i tres dominis de fibronectina (Fn) a la regió extracel·lular.Aquests dominis extracel·lulars van seguits d'una regió proximal de la membrana i d'una hèlix transmembrana única 39. Una regió intracel·lular no estructurada es troba a l'extrem C-terminal i conté motius de seqüència conservats que medien la unió de proteïnes efectores39.La regió que s'estén des dels aminoàcids ~ 1100 a 1600 està majoritàriament desordenada.Hem trobat que MX1 interacciona amb ROBO1 a través de dominis Ig, Fn i intracel·lulars, mentre que la majoria de les interaccions amb STAT1 es produeixen entre el seu CCD, el domini de l'enllaç i el C-terminal de ROBO1 (Fig. 4A, E).D'altra banda, les interaccions amb les regions enllaçadores DI, DIII i OAS3 es van distribuir per tota la proteïna ROBO1 (Fig. 4A).
La família de proteïnes de l'oligoadenilat sintasa (OAS) accepta i s'uneix a l'ARN de doble cadena intracel·lular (dsRNA), experimenta canvis conformacionals i sintetitza oligoadenilats enllaçats amb 2',5' (2-5 As) 40 .Es va trobar que entre els tres OAS, l'OAS3 presenta la major afinitat per l'ARNdc i sintetitza la menor quantitat de 2-5 As, que pot activar la RNasa L i, per tant, limitar la replicació viral 41 .La família de l'OAS consta de dominis de transferasa de nucleòtids semblants a la polimerasa beta (pol-β).Investigacions anteriors han demostrat que l'activitat catalítica del domini C-terminal (DIII) depèn del domini d'unió a l'ARNds (DI), que és necessari per a l'activació d'OAS342.Vam observar que els dominis DI i DII d'OAS3 interaccionen amb CCD i una petita regió d'unió entre SH2 i STAT1 TAD (figura 4A, F).La superposició de diferents llocs de reticulació a l'estructura de la proteïna va revelar una interacció entre el full β i el bucle DBD STAT1 i una butxaca o cavitat oberta formada per residus 60-75 al domini DI de OAS3 (Fig. 4G).L'orientació de les proteïnes del complex també va indicar que cap de les interaccions amb OAS3 interferia amb la capacitat d'unió a l'ADN del seu domini DI (Fig. S1A).A més, el domini N-terminal de GTPase MX1 interacciona àmpliament amb els dominis DI i DIII de OAS3 (Fig. 4A).També vam observar una interacció entre OAS1 i MX1 en les tres repeticions tractades amb IFNα, on un únic domini OAS1 (també catalíticament actiu) va interactuar amb els tres dominis MX1 (figura S2A, B).
Les proteïnes MX formen part d'una gran família de GTPases semblants a la dineïna que contenen un domini GTPasa N-terminal que s'uneix i hidrolitza GTP, un domini intermedi que media l'autoassemblatge i una cremallera de leucina C-terminal que actua com a GTPasa (LZ). ).domini domini efector25,43.MX1 s'uneix a subunitats de polimerases virals per bloquejar la transcripció del gen viral43.Una pantalla de dos híbrids de llevats informada anteriorment va mostrar que MX1 associada a PIAS1 inhibeix l'activació del gen mediada per STAT1 bloquejant l'activitat d'unió a l'ADN i també té activitat lligasa SUMO E344,45.Aquí, demostrem que MX1 s'uneix a STAT1 (Figura 4C, D), però com aquesta interacció afecta l'activació del gen mediada per STAT1 en resposta a IFNα necessita més estudi.A més, també vam trobar que MX1 va interactuar amb IFIT3 i DDX60 en les tres repeticions tractades amb IFNα (Fig. S2C).
DDX60 és una helicasa citoplasmàtica induïda per IFN que anteriorment s'ha informat que juga un paper en la degradació independent de RIG-I de l'ARN46 viral.Interacciona amb RIG-I i activa la seva senyalització d'una manera específica del lligand 46. DDX60 consta d'un domini helicasa DEXD/H-Box i un domini helicasa C-terminal que s'uneixen a l'ARN viral i l'ADN47.La majoria de les seves interaccions amb MX1 i IFIT3 es produeixen dins de llargues regions N- i C-terminals sense dominis o motius canònics (Fig. S2E, F).Tanmateix, MX1 també s'associa amb el domini de l'helicasa DEXD/H-Box (Fig. S2E).Les proteïnes de la família IFIT tenen còpies en tàndem d'un motiu distintiu d'hèlix-gir-hèlix anomenat repetició de tetrapèptid (TPR).Es va trobar que IFIT3 era un modulador positiu de la senyalització RIG-I i, per tant, un component del complex MAVS.En conjunt, les nostres dades suggereixen que IFIT3 i DDX60 interactuen principalment a la regió entre TPR 3-6 d'IFIT3 i poden tenir un paper en la senyalització RIG-I/MAVS (Fig. S2F).
Atès que el cribratge de tot el proteoma és computacionalment intensiu, després vam examinar tota la base de dades UniProt humana per detectar la presència d'una de les repeticions tractades amb IFNα.En aquesta rèplica, hem trobat diverses xarxes d'interacció altament fiables per a HLA-A.L'anàlisi de les vies de proteïnes identificades per espectres de MS/MS va demostrar que el processament i presentació d'antigen basat en MHC-I és la via principal induïda per l'interferó (Fig. 3D).Per tant, ens vam centrar a estudiar les interaccions proteiques de les molècules MHC-I amb un alt grau de confiança en totes les mostres reticuladas.HLA consta de dominis α1, α2 i α3 i cadenes lleugeres, i la microglobulina β2 (β2m) és una proteïna de chaperona constant49.Un cop muntat al reticle endoplasmàtic, l'HLA és inestable en absència de lligands peptídics50.El solc d'unió al pèptid està format pels dominis α1 i α2 altament polimòrfics i no estructurats en forma no pèptid i el domini α351 relativament menys polimòrfic.En presència d'IFNα, vam detectar dos complexos HLA-A: un interacciona amb HMGA1 i H2B (figura 5, taula S3) i l'altre interacciona amb MDN1, LRCH4 i H2B (figura 6).
IFNα indueix una xarxa d'interacció HLA-A amb H2B (H2BFS) i HMGA1.(A) Gràfic 2D (generat al programari SIM-XL) que representa diferents tipus d'interaccions al complex H2B-HLA-A-HMGA1: interenllaç (blau), interenllaç (vermell) i enllaç únic (negre)..Els dominis de diferents identitats estan codificats per colors32: H2B (histona; 2–102) i MHC-I (MHC_1; 25–203, grup C1; 210–290 i MHC_I_C; 337–364).El llindar d'enllaç creuat es va establir en 3,5.Els diagrames de punts indiquen llocs d'interacció HLA-A amb H2B (B) i HMGA1 (C), així com llocs d'interacció K o S entre els dos pèptids.A la figura, el llindar de puntuació d'enllaç creuat s'estableix en 3,0.(D) Relacions entre proteïnes mostrades a les estructures de les proteïnes H2B, HLA-A i HMGA1 al programa PyMOL.Aquestes estructures es van modelar mitjançant el servidor Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) i les estructures de plantilla per a les proteïnes H2B, HLA-A i HMGA1 eren 1kx552, 1kj349 i 2eze55, respectivament.
IFNα indueix una xarxa d'interacció HLA-A amb H2B (H2BFS), MDN1 i LRCH4.(A) Enllaços creuats intramoleculars (vermell) i intermoleculars (blau) presentats en un mapa interactiu 2D (generat al programari SIM-XL) amb MDN1 representat com un cercle.El llindar d'enllaç creuat es va establir en 3,5.Els dominis de diferents identitats estan codificats per colors32: H2B (histona; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grup C1; 210–290 i MHC_I_C; 337–364) i LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) i CH (535–641)).(B) Relacions entre proteïnes mostrades a les estructures de les proteïnes H2B, HLA-A, LRCH4 i MDN1 al programa PyMOL.Aquestes estructures es van modelar mitjançant el servidor Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) amb estructures de plantilla 1kx552, 1kj349, 6hlu62 i 6i2665 per a les proteïnes H2B, HLA-A, LRCH4 i MDN1, respectivament.Gràfics de punts que mostren els llocs d'interacció K o S per a HLA-A amb H2B (C), LRCH4 (D) i MDN1 (E).Per a les trames, el llindar de puntuació d'enllaç creuat es va establir en 3,0.
A més de mantenir la integritat del genoma, la histona H2B també està implicada en la regulació de la transcripció.La proteïna H2B consta d'un domini d'histona central (HFD) format per tres hèlixs α separades per bucles i una cua C-terminal 41,52.La major part de la interacció amb H2B es produeix a l'hèlix α1, que proporciona trimerització amb l'heterodímer HFD (Fig. 5A, B).Tot i que les lisines estan implicades en la unió a l'ADN, algunes lisines també són llocs alternatius d'acetilació o metilació.Per exemple, els residus K43, K46 i K57 de H2B no estan implicats en la unió directa de l'ADN, però són objectius de diverses modificacions post-transcripcionals53.De la mateixa manera, els residus K44, K47 i K57 a H2B poden tenir un paper alternatiu en presència d'IFNα, incloses les interaccions amb altres proteïnes (Fig. 5A, B).A més, la histona extracromosòmica H2B activa la resposta immune en diversos tipus de cèl·lules, actuant com a sensor citosòlic per detectar fragments d'ADN de doble cadena (dsDNA) derivats d'agents infecciosos o cèl·lules danyades54.En presència de virus d'ADN, l'esgotament de H2B va inhibir la producció d'IFN-β i la fosforilació STAT154.També se sap que H2B entra i surt del nucli més ràpid que altres histones centrals54.També es van observar interaccions H2B amb MDN1 i LRCH4 en mostres seleccionades no tractades.Vam trobar que HLA-A va interactuar amb H2B en les tres mostres tractades amb IFNα i en una mostra repetida no tractada.Aquestes dades reflecteixen el paper de H2B en una funció fisiològica alternativa independent de la regulació transcripcional.
HMGA1 (grup d'alta mobilitat AT-Hook 1), una petita nucleoproteïna rica en aminoàcids promotors de malalties, s'ha identificat en associació amb HLA-A.Té una cua C-terminal àcida i tres DBD diferents anomenats ganxos AT perquè s'uneixen al solc menor de la regió rica en AT del dsDNA55,56.Aquesta unió fa que l'ADN es doblegui o redreixi, permetent que els factors de transcripció canònics accedeixin a la seva seqüència de consens.Es creu que la cua C-terminal està implicada en les interaccions proteïna-proteïna i en el reclutament de factors de transcripció, ja que els mutants de supressió C-terminal no poden iniciar la transcripció57.A més, aquest domini conté diversos llocs de fosforilació conservats que són substrats coneguts per a les quinases 58 .Hem observat interaccions HLA-A i H2B amb HMGA1 fora del domini C-terminal, cosa que suggereix que el domini C-terminal s'utilitza principalment per a la unió del factor de transcripció (Fig. 5A, C).Les proteïnes HMGA competeixen amb la histona H1 per unir-se a l'ADN adaptador, augmentant així l'accessibilitat57.De la mateixa manera, sembla probable que HMGA interaccioni amb la histona H2B al llarg de l'ADN enllaçador en competència amb la histona H1.HMGB1 indueix l'expressió de HLA-A, -B i -C a les cèl·lules dendrítiques, donant lloc a la seva activació59, però no s'ha informat prèviament d'una interacció entre HMG i HLA.Hem trobat que HMGA1 interacciona amb els dominis α1 i α3 de HLA-A, amb la majoria de les interaccions fora del seu 3 DBD (figura 5A, C).A les nostres mans, es va trobar que l'HLA-A estava localitzat al nucli (dades no mostrades) i atès que H2B i HMGA1 també estan presents al nucli, és probable que aquesta interacció es produeixi al nucli.A la figura 5D es mostren aductes específics mesurats entre H2B, HLA-A i HMGA1.
La majoria de les interaccions de HLA-A amb altres proteïnes es produeixen dins dels seus dominis α1 i α2 i el domini C-terminal desordenat (Fig. 6).En un d'aquests exemples, vam trobar que HLA-A interacciona amb la cua N-terminal desordenada de LRCH4 (figura 6A, D).LRCH4 regula l'activació de TLR4 i la inducció de citocines LPS, modulant així la resposta immune innata60,61.És una proteïna de membrana amb nou repeticions riques en leucina (LRR) i un motiu d'homologia de calmodulina (CH) en el seu ectodomini, seguit d'un domini transmembrana (TMD) 60 , 62 .S'ha informat que els dominis CH medien les interaccions proteïna-proteïna 60 .Un tram d'uns 300 aminoàcids entre els dominis LRR i CH és relativament accessible però desordenat.A partir de la funció de les regions desordenades com a mediadores de les xarxes proteïna-proteïna i del transport vesicular 63 , vam trobar que la majoria de les interaccions proteïnes es produeixen a les regions desordenades.Les interaccions amb MDN1 es van distribuir al llarg de la proteïna, inclosos els dominis LRR1, LRR6, CH i regions aleatòries, mentre que H2B es va unir principalment al domini CH (Fig. 6A, B).En particular, cap de les interaccions incloïa l'ATM, cosa que suggereix l'especificitat de l'enfocament CLMS (figura 6A, B).
MDN1 també s'ha identificat com a part de la xarxa de proteïnes HLA-A (figura 6A).Pertany a la família de proteïnes AAA (ATPases associades a diferents activitats).Aquest és el mateix domini AAA N-terminal que s'organitza en un anell hexamèric i elimina el factor d'assemblatge de la subunitat ribosòmica 60S 64.sembla ser similar a la dineïna64,65,66.A més, la regió rica en Asp/Glu és seguida pel domini MIDAS (lloc dependent d'ions metàl·lics).A causa de la gran mida de MDN1 (aproximadament 5600 aminoàcids) i la seva homologia limitada amb proteïnes ben estudiades, se sap poc sobre la seva estructura i funció en humans.Hem identificat HLA-A, H2B i LRCH4 com a socis d'unió a MDN1 i vam revelar la seva orientació com a complexos proteics en PyMol (Fig. 6A, B).Aquestes tres proteïnes interaccionen amb el domini AAA, el domini enllaçador semblant a la dineïna i possiblement el domini MIDAS MDN1.En un informe anterior, la purificació per afinitat de proteïnes d'esquer va identificar MDN1 com una proteïna associada a la histona H2B67.A més, un estudi recent també va informar d'una interacció entre MDN i HLA-B en cèl·lules HCT116 mitjançant espectrometria de masses purificada per afinitat, donant suport als nostres resultats68.La identificació d'aquest complex en mostres tractades amb IFNα suggereix un paper per a MDN1 en la senyalització d'interferó.
Com que els gens HLA són altament polimòrfics, vam extreure lectures de seqüenciació que mapegen HLA-A, -B i -C de les dades de seqüenciació d'ARN de cèl·lules Flo-1 (dades no mostrades).Les seqüències de pèptids coherents amb la lectura de seqüenciació van revelar diferències significatives entre HLA-A, -B i -C a les regions on es trobaven pèptids reticulats a HLA-A (figura S3).A més, no vam observar la reticulació de proteïnes a proteïnes de molècules HLA-B/C amb proteïnes H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Això suggereix que la interacció proteica que es troba entre HLA-A, MDN1, LRCH1 i HMGA1 és específica de HLA-A.A més, l'anàlisi proteòmica de mostres no reticuladas (taula S4) va demostrar que HLA-A té una cobertura de seqüència més alta en comparació amb HLA-B o HLA-C.Els pèptids identificats per a HLA-A eren d'alta intensitat tant en mostres tractades amb IFNα com en mostres no tractades.
Per assegurar-nos que les interaccions identificades aquí no es deuen a un enllaç creuat inespecífic de dues proteïnes en una estreta proximitat espacial, vam confirmar dos nous factors d'interacció HLA-A mitjançant la realització d'assajos de co-immunoprecipitació.Les interaccions HLA-A amb MDN1 i H2B endògens es van detectar tant a les cèl·lules Flo-1 tractades amb IFNα com a les no tractades (figura 7, figura S4).Vam confirmar que HLA-A va ser capturat per H2B als immunoprecipitats i que aquesta associació es devia al tractament amb IFNα, ja que HLA-A estava absent a les mostres d'immunoprecipitats de cèl·lules no tractades (figura 7A).Tanmateix, les nostres dades suggereixen que l'IFNα regula de manera diferent la unió HLA-A a H2B i MDN1.IFNα indueix associació entre H2B i HLA-A, però redueix la seva associació amb MDN1.Vam trobar que MDN1 estava associat amb HLA-A en els controls, i l'addició d'IFNα va reduir aquesta interacció independent de la inducció de MDN1 per IFNα (figura 7B, C).A més, la immunoprecipitació HLA-A va capturar H2B a les cèl·lules A549 (Fig. S4), cosa que suggereix que aquesta interacció és independent del tipus cel·lular.En conjunt, aquests resultats donen suport a les interaccions mediades per interferó de HLA-A amb H2B i MDN1.
HLA-A co-purifica H2B i MDN1.Es van immunoprecipitar immunoblots H2B (A) i MDN1 (B) endògens representatius de cèl·lules Flo-1 tractades amb IFNα i es van sondar els anticossos indicats.Es van utilitzar IgG de ratolí i conill com a control negatiu.(C) Les quantitats relatives (entrada) de diferents antígens es representen mitjançant immunoblots sondats contra anticossos indicats, la β-actina es va utilitzar com a control de càrrega.
Es van investigar les propietats estructurals d'una de les xarxes entrecreuades altament fiables induïdes per interferó, H2B-HLA-A-HMGA1.Hem utilitzat el modelatge de la dinàmica molecular com a enfocament alternatiu per entendre la dinàmica conformacional de les proteïnes implicades en aquest complex (figura 8).Les inferències de les dades de CLMS suggereixen la possibilitat de diferents conformacions de les proteïnes H2B, HLA-A i HMGA1.Per tant, es van modelar els següents complexos potencials en un medi dissolvent: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A i H2B-HLA-A-HMGA1.Una pantalla d'acoblament proteïna-proteïna inicial utilitzant el paquet MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canadà) va suggerir possibles conformacions que difereixen entre aquestes proteïnes (Fig. 8A).La visualització del complex de proteïnes d'acoblament va revelar diverses interaccions i possibles conformacions (figura 5A, 8).Així, a la figura 8A es mostra una possible conformació (amb enllaços creuats etiquetats) i es va avaluar encara més mitjançant el pipeline de modelització MD.A més, la unió de H2B o HMGA1 a HLA-A posa de manifest la major afinitat de H2B per HLA-A (Fig. 8A).
Dinàmica conformacional de possibles xarxes entre els complexos H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A i H2B-HLA-A-HMGA1.(A) El panell esquerre és un mapa 2D (generat al programari SIM-XL) d'enllaços de creuament intramoleculars (vermell) i intermoleculars (blau) (tall de reticulació establert en 3,5).A més, els residus de reticulació identificats estan marcats a les estructures de les proteïnes H2B, HLA-A i HMGA1.Les conformacions associades d'aquestes proteïnes es van extreure mitjançant la canalització d'acoblament implementada al paquet MOE.El panell inferior esquerre mostra les diferents conformacions possibles dels complexos H2B-HLA-A i HMGA1-HLA-A amb diferents afinitats d'unió proteïna-proteïna (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Desviació estàndard (RMSD) de les posicions atòmiques (excloent els àtoms d'hidrogen) per a cada estructura de proteïnes.(C) Interaccions d'enllaç d'hidrogen proteïna-proteïna intermolecular de diversos complexos simulats tenint en compte interaccions específiques de durada ≥ 10 ns.La distància de tall donant-acceptador de l'enllaç h es va establir en 3, 5 Å i l'angle de tall donant-acceptador H es va establir en ≥ 160 °–180 °.(D) Residus marcats que formen interaccions proteïna-proteïna HLA-A amb els seus respectius socis, que abasten ≥ 20 ns, extrets de complexos HLA-A-H2B i HLA-A-HMGA1 ficticis.Les estructures de proteïnes representen una estructura mitjana de 100 ns MDS.(E) Interaccions entre els complexos HLA-A-H2B i HLA-A-HMGA1 en comparació amb les interaccions rastrejades per la simulació H2B-HLA durant 100 ns en funció del lloc d'interacció K o S entre els dos pèptids.Complexos /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.El valor llindar per a l'avaluació dels enllaços creuats es va establir en 3, 0 i es van tenir en compte les interaccions específiques de MDS que tenien ≥ 10 ns.Les estructures de proteïnes es van visualitzar mitjançant paquets BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, EUA) i Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canadà).
L'estabilitat de les molècules HLA-A al llarg del temps (desviació estàndard; RMSD o desviació estàndard; RMSF) va indicar que la presència de proteïnes H2B o HMGA1 als complexos va estabilitzar HLA-A (figura 8B, figura S5).La proteïna HMGA1 s'uneix fortament al lloc B2M de HLA-A, induint l'estabilitat dels aminoàcids HLA-A al complex HLA-A-HMGA1 o H2B-HLA-A-HMGA1 (figura 8B, figura S5).en particular, es va trobar que els residus HLA ~60-90 i ~180-210 eren menys flexibles en presència d'H2B (FIG. 8B).H2B i HMGA1 van mostrar una millor unió a HLA-A al complex H2B-HLA-A-HMGA1 en comparació amb la unió HLA-A a H2B o HMGA1 només (Figura 8C, D; Taula S5).Els residus implicats en l'enllaç d'hidrogen (modelada MD d'alta ocupació ≥ 10 ns) coincideixen amb els llocs d'interacció CLMS (residus K o S) al complex, cosa que suggereix que les interaccions identificades per CLMS són molt fiables.Fiabilitat (Fig. 8E).En el modelatge CLMS i MD, es va trobar que els residus HLA-A entre uns 190-210 i uns 200-220 aminoàcids s'uneixen a H2B i HMGA1, respectivament (FIG. 8E).
Les interaccions proteïna-proteïna formen xarxes estructurals dinàmiques que medien la comunicació intracel·lular en resposta a determinats estímuls.Com que molts enfocaments de proteòmica detecten canvis en el nivell d'estat estacionari general d'una proteïna, la dinàmica d'interacció proteïna-proteïna requereix eines addicionals per capturar interfícies d'unió, i CLMS és una d'aquestes eines.El sistema de senyalització d'interferons és una xarxa de citocines que permet que les cèl·lules responguin a una sèrie de senyals patògens i patològics intrínsecs ambientals, que culminen amb la inducció de subconjunts de proteïnes induïbles per interferó.Hem aplicat CLMS per determinar si es podrien identificar noves interaccions proteïna-proteïna entre un panell de proteïnes induïdes per interferó.Es va utilitzar l'anàlisi global de reticulació de proteïnes en un model de cèl·lules Flo-1 sensibles a interferó per capturar complexos de proteïnes.L'extracció de pèptids tríptics de cèl·lules no entrecreuades i entrecreuades permet el recompte de pèptids, l'enriquiment de la via i la distribució de la longitud del pèptid amb una intensitat de LFQ definida.Les proteïnes canòniques inducibles per interferó es van identificar com un control intern positiu, mentre que es van observar nous adductes intermoleculars i intramoleculars reticulats de proteïnes canònices inducibles per interferó com MX1, UP18, OAS3 i STAT1.S'han investigat diverses característiques estructurals i interaccions en àrees funcionals.
Es va detectar una interacció entre HLA-A, MDN1 i H2B mitjançant immunoblot en cèl·lules Flo-1 i A549 tractades i no tractades amb IFNα.Els nostres resultats posen de manifest que HLA-A es complexa amb H2B de manera dependent d'IFNα.El nostre treball representa una via interessant per a una exploració addicional de la co-localització d'aquests dos complexos.També seria interessant ampliar l'enfocament CLMS a un panell de línies cel·lulars per identificar les interaccions de proteïnes mediades per interferó independents del tipus cel·lular.Finalment, vam utilitzar el modelatge MD com a enfocament alternatiu per entendre la dinàmica conformacional de les proteïnes implicades en el complex H2BFS-HLA-A-HMGA1, que va fer un seguiment de les converses intramoleculars i intermoleculars.Les inferències de les dades de CLMS suggereixen la possibilitat de diferents conformacions de les proteïnes H2BFS, HLA-A i HMGA1.Les possibles diferents conformacions entre aquests complexos de proteïnes d'acoblament van revelar diverses interaccions similars a les observades al conjunt de dades CLMS.Un dels principals punts forts del nostre mètode és que permet la identificació fàcil de gens altament polimòrfics en interacció com l'HLA, per la qual cosa serà interessant estudiar les interaccions de proteïnes específiques de l'haplotip HLA que d'altra manera són difícils d'estudiar.En conjunt, les nostres dades demostren que CLMS es pot utilitzar per ampliar la nostra comprensió de les xarxes de senyalització induïdes per interferó i proporcionar una base per estudiar sistemes intercel·lulars més complexos en el microentorn del tumor.
Les cèl·lules Flo-1 es van obtenir d'ATCC i es van mantenir en DMEM (Gibco) complementat amb un 1% de penicil·lina/estreptomicina (Invitrogen), un 10% de sèrum fetal boví (Gibco) i es van emmagatzemar a 37 ° C i un 5% de CO2.Incubació.Les cèl·lules es van cultivar fins al 70-80% de confluència abans de ser tractades amb IFNα14 (fabricat per Edinburgh Protein Production Facility).Tots els altres productes químics i reactius es van comprar a Sigma Aldrich tret que s'indiqui el contrari.
Les cèl·lules Flo-1 es van cultivar en plaques de 6 pous i l'endemà es van tractar les cèl·lules amb 10 ng/ml d'IFNα14 durant 24 hores fins a una confluència aproximadament del 80%.Les cèl·lules es van rentar tres vegades amb PBS i es van lligar amb DSS (Thermo Fisher Scientific) acabat de preparar (dissolt en DMSO) en PBS durant 5 min a 37 ° C fins a una concentració final de 0, 5 mM.La reacció de reticulació de DSS es va substituir per PBS i el DSS residual es va apagar afegint 20 mM de Tris (pH 8, 0) en PBS durant 15 min a 37 ° C.Les cèl·lules es van recollir per raspat i es van recollir en tubs de baixa unió (axigen).
El pellet cel·lular es va lisar amb 300 µl de tampó de lisi d'urea (urea 8 M, Tris 0, 1 M, pH 8, 5) durant 30 min a temperatura ambient amb sacsejada ocasional.Tots els passos de centrifugació es van realitzar a 14.000 xg a 8 ° C.Centrifugar el lisat durant 10 minuts i transferir el sobrenedant a un tub nou.Les partícules clares restants es van dissoldre en 150 μl del segon tampó de lisi (urea 2 M, SDS al 2% (p/v) (dodecil sulfat de sodi)) durant 30 minuts o més fins que es va obtenir una solució aquosa homogènia.El lisat es va centrifugar durant 20 minuts i el sobrenedant es va barrejar amb el lisat obtingut en el pas anterior.Les concentracions de proteïnes es van avaluar mitjançant l'assaig Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) segons les instruccions del fabricant per als procediments de microplaques.Les mostres es van congelar ràpidament en nitrogen líquid i es van emmagatzemar a -80 °C.
Es van processar aproximadament 100 μg de proteïna reticulada soluble mitjançant un protocol de preparació de mostres de filtració modificat (FASP) tal com descriu Wisniewski et al.69 Breument, la proteïna es reticula amb 200 µl de tampó d'urea (urea 8 M en Tris 0,1 M, pH 8,5), es vortex i es redueix a la meitat.Tots els passos de centrifugació es van realitzar a 14.000 xg a 25 ° C.La primera meitat del lisat de proteïnes reticulats es va transferir a un dispositiu de filtre centrífug Microcon de 10 kDa equipat amb una membrana Ultracel-10 (Merck), seguit de centrifugació al filtre durant 25 minuts.A continuació, afegiu la segona meitat de la proteïna al filtre i repetiu els mateixos passos.La recuperació de proteïnes es va realitzar afegint 100 μl de clorhidrat de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 17 mM en tampó d'urea.La recuperació es va agitar en una termomescladora a 600 rpm durant 30 min a 37 °C.A més, es va centrifugar la columna i es va alquilar la proteïna reticulada reduïda utilitzant 100 μl de iodoacetamida 50 mM en tampó d'urea.La reacció d'alquilació es va dur a terme a temperatura ambient durant 20 minuts a la foscor.Gireu la columna, renteu les parets de la columna 3 vegades amb 100 µl de tampó d'urea i després centrifugueu.La mateixa operació es va realitzar 3 vegades amb 100 μl de bicarbonat d'amoni 100 mM.Abans de la tripsinització, substituïu el tub de recollida per un de nou.Afegiu tampó de digestió que conté bicarbonat d'amoni 50 mM i 1 µl de tripsina diluït en tampó de tripsina (Promega).La proporció de tripsina a proteïna es va mantenir al voltant d'1:33, i les reaccions de digestió es van incubar durant la nit a 37 ° C en una cambra humida.El pèptid reticulat es va eluir del filtre per centrifugació durant 25 minuts.La recuperació de pèptids es va millorar afegint 50 μl de NaCl 0, 5 M al filtre, seguit de centrifugació durant 25 minuts.
Les columnes C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) es van utilitzar per dessalar pèptids tríptics reticulats seguint el protocol descrit per Bouchal et al.70 amb petites modificacions.Breument, les columnes de centrifugació C18 es van activar amb tres rentats d'àcid fòrmic (FA) al 0,1% en acetonitril (AcN) (Merck) i dos rentats de FA al 0,1%.La columna es va hidratar amb 0,1% de FA durant 15 minuts.Carregueu les mostres a les columnes de centrifugació i renteu-les 3 vegades amb 0,1% de FA.Els pèptids dessalats es van eluir seqüencialment amb un gradient pas a pas utilitzant 50%, 80% i 100% AcN en 0, 1% FA.Les mostres es van assecar en un concentrador SpeedVac Plus (Eppendorf) fins que el líquid residual va desaparèixer completament.Els pèptids eluïts es van dissoldre en 100 μl d'àcid trifluoroacètic al 0, 08% en AcN al 2, 5% i es van mesurar les concentracions en un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Es va injectar aproximadament 1 μg de pèptid reticulat per mostra al sistema LC-MS/MS.
Els pèptids reticulats es van separar en un sistema UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) connectat a un espectròmetre de masses Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Els pèptids reticulats es van recollir en una columna de captura C18 µ-pre-columna de 300 µm d'ID de 5 mm de llarg empaquetada amb sorbent C18 PepMap100 i sorbent PepMap de 5 µm (Thermo Scientific).Carregueu el cabal de la bomba establert a 5 µl/min d'àcid trifluoroacètic al 0,08% dissolt en AcN al 2,5%.Els pèptids reticulats es van separar en una columna de sílice fosa analítica amb un diàmetre interior de 75 μm i una longitud de 150 mm, plena amb un sorbent PepMap de 2 μm (Thermo Scientific).Les fases mòbils A i B consistien en 0,1% FA en aigua i 0,1% FA en acetonitril, respectivament.El gradient comença al 2,5% de B i augmenta linealment fins al 40% de B durant 90 minuts, i després fins al 90% de B durant els 2 minuts següents.La composició de la fase mòbil es va mantenir al 90% de B durant 10 minuts i després es va reduir linealment fins al 2, 5% de B durant 2 minuts.La columna es va equilibrar al 2,5% de B durant 8 minuts abans del següent cicle.Els pèptids reticulats eluïts de la columna analítica es van ionitzar en una font d'ionització de nanoelectrospray (NSI) i es van injectar en un espectròmetre de masses Exploris 480 (Thermo Scientific).
L'espectròmetre de masses Orbitrap Exploris 480 funcionava en el mode de correlació de dades positiva.Es va realitzar una exploració completa en mode de secció a una resolució de 120.000 amb configuracions de rang des de m/z 350 Th fins a m/z 2000 Th.L'objectiu AGC normalitzat es va establir al 300% amb un temps d'entrada màxim de 50 ms.S'ha establert la detecció de pics monoisotòpics per als pèptids.El paràmetre de relaxació de la restricció s'estableix en true si es troben massa pocs precursors.La força iònica mínima del precursor es va establir en 5,0e3 i es van incloure estats de càrrega del precursor fins a +8 als experiments.
El temps de cicle entre exploracions principals en mode de correlació de dades es va establir en 2,5 segons.L'exclusió de massa dinàmica es va establir en 20 s després de la primera fragmentació de l'ió precursor.La finestra d'aïllament del precursor es va establir en 2 Th.El tipus d'energia de col·lisió normalitzada amb un mode d'energia de col·lisió fixa es va escollir en una exploració MS/MS dependent de dades.Energia de col·lisió establerta al 30%.La resolució d'Orbitrap es va establir en 15.000 i l'objectiu AGC al 100%.El temps d'injecció màxim personalitzat s'estableix en 60 mil·lisegons.
Abans de fer el seguiment de la xarxa proteïna-proteïna en mostres enllaçades, vam processar els fitxers en brut mitjançant el paquet MaxQuant (versió 1.6.12.0)26,27 per identificar pèptids/proteïnes traçables a les mostres.A més, es van realitzar anàlisis proteòmiques similars en mostres de Flo-1 no reticulats tractades i no tractades amb IFNα.Les dades de MS/MS es van cercar a la base de dades humana UniProt (www.uniprot.org) (penjat el 12 d'agost de 2020, conté 75.093 entrades) mitjançant el motor de cerca integrat Andromeda27.La recerca es va dur a terme sense indicar l'especificitat de l'enzim i diverses modificacions de desamidació (N, Q) i oxidació (M).Les toleràncies de massa del precursor es van establir a 20 ppm i els ions de producte a 0, 02 Da.La desviació de la massa inicial i màxima es va establir en 10 ppm.La massa màxima del pèptid es va establir en 4600 Da i la similitud de seqüències es va establir entre 7 i 25 aminoàcids (aa).Es va realitzar una anàlisi estadística addicional mitjançant el programa Perseus (versió 1.6.10.45).El contingut de proteïnes es va calcular normalitzant la intensitat espectral de la proteïna (intensitat LFQ; quantificació sense etiqueta)27 i els valors d'intensitat es van convertir a Log2.Es va crear un agrupament jeràrquic de proteïnes identificades per la seva intensitat de pèptids mitjançant el paquet pheatmap (v1.0.12) a R (v 4.1.2).L'anàlisi d'enriquiment de la via es va realitzar mitjançant la base de dades de la via Reactome per a proteïnes tractades amb IFNα que es van activar més de quatre vegades en comparació amb mostres no tractades.
La identificació d'enllaços químics específics de lisina (K) o serina (S) de complexos proteics monitoritzats per LC-MS/MS es va realitzar mitjançant una màquina d'identificació espectroscòpica (SIM-XL) per a pèptids reticulats (SIM-XL)29.En primer lloc, es van investigar les possibles interaccions entre els gens de signatura de resistència al dany de l'ADN (IRDS) associats a interferó (IFN) mitjançant el conjunt de dades de proteïnes IRDS descrit a Padariya et al.28.El cribratge de totes les condicions i repeticions de l'UniProt humà complet és computacionalment intensiu, de manera que tota la base de dades UniProt humana (www.uniprot.org) (descarregada el 12 d'agost de 2020, conté 75.093 entrades) contra repeticions tractades amb IFNα.Un dels filtres per a interaccions d'alta confiança.Aquestes interaccions d'alta importància obtingudes es van ampliar i provar en totes les repeticions i condicions.
A SIM-XL, es va utilitzar DSS per al reticulant (XL) i el canvi de pes XL i el canvi de pes de modificació es van establir a 138,06 i 156,07, respectivament.Es consideren els següents llocs de reacció de reticulació: KK, KS i KN-TERM, sense ions indicadors.Tant el precursor com el fragment ppm es van establir en 20 i el llindar Xrea es va establir en 0,15.Es va considerar que la tripsina era completament específica i es va implementar un mètode de fragmentació de trampa C d'alta energia (HCD).El llindar de reducció de DB dinàmica XCorr i el nombre mínim de pèptids per a la reducció de DB dinàmica es van establir en 2, 5 i 2, respectivament.Altres paràmetres són: probabilitat de monoisòtops i tall de coincidència màxima, mínim 4 residus AA per cadena i càrrega màxima de cadena, i 3 màxims de divisions perdudes.Els mapes 2D cosits resultants es van analitzar a (SIM-XL) i es va utilitzar la representació gràfica xQuest28 per construir els mapes 2D.Els enllaços de proteïnes a les estructures de proteïnes es proporcionen a PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, versió 2.0 Schrödinger, LLC).
Les estructures de model de proteïnes es van crear mitjançant el servidor Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 utilitzant els principis de modelització d'homologia i implementació del "Mètode de Markov Ocult".Phyre2 genera estructures model basades en l'alineació de seqüències amb estructures de proteïnes conegudes.Per a les proteïnes H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 i MDN1, es van utilitzar estructures de plantilla 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 i 6i2665.A més, també es va considerar l'estructura d'AlphaFold71 MX1, UBP18 i ROBO1.L'estructura de la proteïna es va visualitzar mitjançant el paquet BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, EUA) i el paquet Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canadà).