Tub enrotllat d'acer inoxidable 347 12,7 * 1,24 mm, mecanisme molecular de condensació electrostàtica sincrònica i coagregació d'α-sinucleïna i tau

Gràcies per visitar Nature.com.Esteu utilitzant una versió del navegador amb suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).A més, per garantir un suport permanent, mostrem el lloc sense estils ni JavaScript.
Controls lliscants que mostren tres articles per diapositiva.Utilitzeu els botons enrere i següent per moure's per les diapositives, o els botons del controlador de diapositives al final per moure's per cada diapositiva.

Especificació de canonades d'acer inoxidable 347

347 12,7 * 1,24 mm Tubs enrotllats d'acer inoxidable

Diàmetre exterior: 6,00 mm OD fins a 914,4 mm OD, mides de fins a 24" NB disponible Ex-stock, OD mida Tubs d'acer disponibles Ex-stock

Interval de gruix de canonada SS 347: 0,3 mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
Pes: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, etc. (0,5-12 mm) O mida no normal que s'adapta segons sigui necessari

Tipus: SS 347 Tubs sense soldadura |Tubs SS 347 ERW |Tubs soldats SS 347 |SS 347 Tubs fabricats |Tubs SS 347 CDW, canonades LSAW / Soldats per costura / Redibuixat

Forma: tubs rodons SS 347, tubs quadrats SS 347, tubs rectangulars SS 347, tubs enrotllats SS 347, forma "U" SS 347, bobines de pastís SS 347, tubs hidràulics SS 347

Longitud: aleatòria simple, aleatòria doble i longitud requerida Extrem: extrem llis, extrem bisellat, trepitjat

Protecció final: Tapes de plàstic |Acabat exterior: 2B, No.4, No.1, No.8 Acabat mirall per a canonades d'acer inoxidable, Acabat segons els requisits del client

Estat de lliurament: recuit i en vinagre, polit, recuit brillant, estirat en fred

Inspecció, informes de proves: certificats de proves de molí, EN 10204 3.1, informes químics, informes mecànics, informes de proves PMI, informes d'inspecció visual, informes d'inspecció de tercers, informes de laboratori aprovats per NABL, informe de proves destructives, informes de proves no destructives

Embalatge: envasat en caixes de fusta, bosses de plàstic, tires d'acer empaquetades o segons les sol·licituds dels clients

Especials: Mides i especificacions diferents de les anteriors es poden fabricar a petició

Interval de mida de canonada SS 347: 1/2 polzada NB, OD a 24 polzades

ASTM A312 347: canonada austenítica soldada sense soldadura i costura recta destinada a alta temperatura i servei corrosiu general.No es permet el metall d'aportació durant la soldadura.

ASTM A358 347: Tub austenític soldat per fusió elèctrica per a servei corrosiu i/o d'alta temperatura.Normalment només es produeixen canonades de fins a 8 polzades amb aquesta especificació.Es permet l'addició de metall d'aportació durant la soldadura.

ASTM A790 347: canonada ferrítica/austenítica (dúplex) soldada sense costures i de costura recta destinada al servei corrosiu general, amb un èmfasi particular en la resistència a la fissuració per corrosió per tensió.

ASTM A409 347: canonada de paret lleugera austenítica de gran diàmetre soldada per fusió elèctrica de costura recta o espiral de mides de 14" a 30" amb parets Sch5S i Sch 10S per a corrosius i/o alts

ASTM A376 347: canonada austenítica sense soldadura per a aplicacions d'alta temperatura.

ASTM A813 347: canonada austenítica d'una sola costura, solda o doble soldada per a altes temperatures i aplicacions corrosives generals.

ASTM A814 347: canonada austenítica soldada en fred per a alta temperatura i servei corrosiu general.

Composició química de canonades d'acer inoxidable 347H

Propietats mecàniques de la canonada d'acer inoxidable 347H

Propietats físiques de les canonades d'acer inoxidable 347H

Graus equivalents per a canonades d'acer inoxidable 347H

L'agregació d'alfa-sinucleïna amiloide (αS) és un segell distintiu de la malaltia de Parkinson i altres sinucleinopaties.Recentment, la proteïna tau associada habitualment a la malaltia d'Alzheimer s'ha associat amb la patologia αS i s'ha trobat que es co-localitza en inclusions riques en αS, tot i que el mecanisme molecular de coagregació de les dues proteïnes encara no està clar.Informem aquí que la fase αS es separa en condensats líquids mitjançant condensació complexa electrostàtica amb polipèptids carregats positivament com ara tau.Depenent de l'afinitat de αS pels polications i la velocitat d'esgotament de la valència de la xarxa de coagulació, els coàguls experimenten una ràpida gelificació o coalescència seguida d'una agregació amiloide lenta.En combinar un conjunt de tècniques biofísiques avançades, vam poder caracteritzar la separació de fases αS/Tau líquid-líquid i identificar els factors clau que condueixen a la formació d'agregats heterogenis que contenen ambdues proteïnes en un condensat de proteïnes líquides.
A més dels compartiments de membrana, la separació espacial a les cèl·lules també es pot aconseguir mitjançant la formació de cossos densos rics en proteïnes i líquids anomenats condensats o gotes biomoleculars, mitjançant un procés conegut com a separació de fase líquid-líquid (LLPS).Aquestes gotes estan formades per interaccions temporals multivalents, generalment entre proteïnes o proteïnes i ARN, i compleixen una varietat de funcions en gairebé tots els sistemes vius.Un gran nombre de proteïnes capaços de LLP presenten seqüències de baixa complexitat que estan molt desordenades a la natura i en la formació de condensats biomoleculars3,4,5.Nombrosos estudis experimentals han revelat la naturalesa flexible, sovint desordenada i multivalent de les proteïnes que formen aquests condensats semblants a líquids, encara que se sap poc sobre els determinants moleculars específics que controlen el creixement i la maduració d'aquests condensats a uns més sòlids. estat..
Les noves dades donen suport a la hipòtesi que els LLPS aberrants impulsats per proteïnes i la transformació de gotes en estructures sòlides poden ser vies cel·lulars rellevants que condueixen a la formació d'agregats tòxics insolubles que sovint són signes distintius de malalties degeneratives.Moltes proteïnes intrínsecament desordenades (IDP) associades a LLPS, sovint altament carregades i flexibles, s'han associat durant molt de temps amb la neurodegeneració mitjançant el procés d'agregació amiloide.En particular, s'ha demostrat que els condensats d'IDP biomoleculars com FUS7 o TDP-438 o proteïnes amb grans dominis de baixa complexitat com hnRNPA19 envelleixen en formes de gel o fins i tot sòlides mitjançant un procés anomenat fluidització.compost.a la transició en fase sòlida (LSPT) en funció del temps o en resposta a determinades modificacions post-traduccionals o mutacions patològicament significatives1,7.
Un altre IDP associat amb LLPS in vivo és Tau, una proteïna alterada associada a microtúbuls l'agregació amiloide de la qual s'ha implicat en la malaltia d'Alzheimer10 però també s'ha implicat recentment en la malaltia de Parkinson (MP) i altres proteinopaties nuclears sinàptiques 11, 12, 13 estan relacionades.S'ha demostrat que Tau es dissocia espontàniament de la solució/citoplasma a causa d'interaccions electrostàtiques favorables14, donant lloc a la formació de gotes enriquides en tau conegudes com a coacervats electrostàtics.També s'ha observat que aquest tipus d'interacció inespecífica és la força impulsora de molts condensats biomoleculars a la natura15.En el cas d'una proteïna tau, l'agregació electrostàtica es pot formar mitjançant una simple agregació, en la qual regions de càrrega oposada de la proteïna desencadenen el procés d'escissió, o per agregació complexa mitjançant la interacció amb polímers carregats negativament com l'ARN.
Recentment, l'α-sinucleïna (αS), un IDP amiloide implicat en la PD i altres malalties neurodegeneratives conegudes col·lectivament com a sinucleinopatia17,18, s'ha demostrat en models cel·lulars i animals19,20 concentrats en condensats de proteïnes amb comportament semblant a un fluid.Estudis in vitro han demostrat que αS pateix LLPS per simple agregació mitjançant interaccions predominantment hidrofòbiques, tot i que aquest procés requereix concentracions de proteïnes excepcionalment altes i temps d'incubació atípicament llargs19,21.Si els condensats que contenen αS observats in vivo es formen per aquest o altres processos LLPS segueix sent un problema clau sense resoldre.De la mateixa manera, tot i que s'ha observat l'agregació d'amiloide αS a les neurones en PD i altres sinucleinopaties, el mecanisme exacte pel qual αS pateix l'agregació amiloide intracel·lular no està clar, ja que la sobreexpressió d'aquesta proteïna no sembla desencadenar aquest procés per si sola.Sovint es requereix dany cel·lular addicional, cosa que suggereix que es requereixen determinades ubicacions cel·lulars o microambients per a la renucleació dels conjunts amiloides αS intracel·lulars.Un entorn cel·lular que és particularment propens a l'agregació pot ser l'interior dels condensats de proteïnes 23 .
Curiosament, s'ha trobat que αS i tau es co-localitzen en inclusions de malalties característiques en humans amb malaltia de Parkinson i altres sinucleinopaties 24,25 i els experiments han informat d'una relació patològica sinèrgica entre les dues proteïnes 26,27 que suggereix una relació potencial entre l'agregació αS i tau en malalties neurodegeneratives.malaltia.S'ha trobat que αS i tau interaccionen i promouen l'agregació de l'altre in vitro i in vivo 28,29 i s'han observat agregats heterogenis compostos per aquestes dues proteïnes en el cervell de pacients amb sinucleinopaties 30 .No obstant això, es coneix poc sobre la base molecular de la interacció entre αS i tau i el mecanisme de la seva co-agregació.S'ha informat que αS interacciona amb tau mitjançant una atracció electrostàtica entre la regió C-terminal altament carregada negativament d'αS i la regió central rica en prolina de tau, que també s'enriqueix en residus carregats positivament.
En aquest estudi, mostrem que αS es pot dissociar en gotetes mitjançant la condensació del complex electrostàtic en presència de proteïna tau, en contrast amb la seva interacció amb altres polipèptids carregats positivament com la poli-L-lisina (pLK) i en aquest procés.αS actua com una molècula de bastida per a la xarxa de gotes.Hem identificat diferències notables en el procés de maduració dels coacervats αS electrostàtics, que s'associen a diferències en la valència i la força de la interacció de les proteïnes implicades a la xarxa de coacervats.Curiosament, vam observar la co-agregació de proteïnes amiloides αS i tau en coacervats líquids de llarga vida i vam identificar alguns factors clau que condueixen a la co-agregació d'aquestes dues proteïnes en aquests coacervats.Aquí descrivim amb detall aquest procés, que és un possible mecanisme molecular subjacent a la colocalització de dues proteïnes en inclusions específiques de la malaltia.
αS té una cua C-terminal altament aniònica a pH neutre (Fig. 1a), i vam plantejar la hipòtesi que podria patir LLPS mitjançant la condensació de complexos electrostàtics amb molècules polipeptídiques policatiniques desordenades.Hem utilitzat una poli-L-lisina (pLK) de 100 residus com a molècula model de partida a causa de la seva naturalesa polimèrica carregada positivament i desordenada a pH neutre 32. Primer, vam confirmar que pLK interacciona amb el domini Ct de αS mitjançant espectroscòpia de RMN de solució. (Figura 1b) utilitzant αS marcat amb 13C/15N en presència de relacions molars creixents αS:pLK.La interacció de pLK amb el domini Ct d'αS es manifesta en pertorbacions del canvi químic i una disminució de la intensitat màxima en aquesta regió de la proteïna.Curiosament, quan vam barrejar αS amb pLK a una concentració d'αS d'aprox.5-25 µM en presència de polietilenglicol (5-15% PEG-8) (tampó LLPS típic: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) immediatament vam passar per un ampli camp de formació de proteïnes .es van observar gotes mitjançant microscòpia de fluorescència (WF) i de camp brillant (BF) (Fig. 1c).Gotetes d'1-5 µm que contenen αS concentrat (afegit αS marcat amb AlexaFluor488 1 µM, AF488-αS), les seves propietats electrostàtiques es poden derivar de la seva resistència al 10% de 1,6-hexanodiol (1,6-HD) i la seva sensibilitat a un augment de la concentració de NaCl (Fig. 1c).La naturalesa fluida dels coacervats del complex electrostàtic αS/pLK es demostra per la seva capacitat de fusionar-se en mil·lisegons (Fig. 1d).Mitjançant turbidimetria, vam quantificar la formació de gotes en aquestes condicions, vam confirmar la naturalesa electrostàtica de la interacció principal associada a la seva estabilitat (Fig. 1e) i vam avaluar l'efecte de diverses proporcions de polímers en el procés LLPS (Fig. 1f).Tot i que s'observa la formació de gotes en una àmplia gamma de proporcions de polímers, el procés és molt favorable quan pLK supera l'αS.També s'han observat LLP utilitzant l'agent desplaçant químicament diferent dextran-70 (70 kDa) o utilitzant una varietat de formats de mostra, incloses gotes de portaobjectes de vidre, pous de microplaques de diversos materials, Eppendorf o capil·lars de quars.
una Representació esquemàtica de diferents regions proteiques a les variants WT-αS i ΔCt-αS utilitzades en aquest estudi.El domini N-terminal amfipàtic, la regió hidrofòbica de formació d'amiloide (NAC) i el domini C-terminal carregat negativament es mostren en blau, taronja i vermell, respectivament.Es mostra el mapa Net Charge Per Residual (NCPR) de WT-αS.b Anàlisi RMN de la interacció αS/pLK en absència de cúmuls macromoleculars.A mesura que augmenta la concentració de pLK (les proporcions molars αS:pLK d'1:0,5, 1:1,5 i 1:10 es mostren en verd clar, verd i verd fosc, respectivament).c Coacervar αS/pLK (proporció molar 1:10) a 25 µM (1 µM pLK marcat amb AF488 o Atto647N per a imatges WF) en tampó LLPS (superior) o complementat amb 500 mM NaCl (inferior esquerra) o després de 110 % 1,6-hexanodiol (1,6-HD; inferior dreta).Barra d'escala = 20 µm.d Imatges microscòpiques representatives de la fusió de gotes BF d'αS/pLK (relació molar 1:10) a una concentració de 25 μM;les fletxes indiquen la fusió de gotes individuals (fletxes vermelles i grogues) en una nova gota (fletxa taronja) en un termini de 200 ms).Barra d'escala = 20 µm.e Dispersió de llum (a 350 nm) Agregació αS/pLK al tampó LLPS abans i després de l'addició de 500 mM de NaCl o 10% 1,6-HD a 25 µM αS (N = 3 rèpliques de mostres, també s'indica la mitjana i la desviació estàndard).f Imatge BF (superior) i anàlisi de dispersió de la llum (a 350 nm, inferior) de l'agregació αS/pLK a 25 μM αS amb una relació molar creixent αS:pLK (N = 3 rèpliques de mostres, també s'indica la mitjana i la desviació estàndard).Barra d'escala = 10 µm.La barra d'escala d'una imatge indica l'escala de totes les imatges d'un plafó.Les dades en brut es proporcionen en forma de fitxers de dades en brut.
A partir de les nostres observacions de condensació del complex electrostàtic αS/pLK i observacions prèvies de αS com a molècula client del condensat tau/ARN mitjançant la interacció directa amb tau31, vam plantejar la hipòtesi que αS i tau podrien co-segregar-se amb el dissolvent en absència d'ARN. condensació.mitjançant complexos electrostàtics, i αS és la proteïna de bastida en coacervats αS/Tau (vegeu la distribució de càrrega tau a la figura 2e).Vam observar que quan es van barrejar 10 μM αS i 10 μM Tau441 (que contenien 1 μM AF488-αS i 1 μM Atto647N-Tau, respectivament) al tampó LLPS, formaven fàcilment agregats de proteïnes que contenien ambdues proteïnes, tal com es veu per la microscòpia WF.(Fig. 2a).La colocalització de les dues proteïnes a les gotes es va confirmar mitjançant microscòpia confocal (CF) (figura suplementària 1a).Es va observar un comportament similar quan es va utilitzar dextran-70 com a agent d'agregació (figura suplementària 1c).Utilitzant PEG o dextran marcat amb FITC, vam trobar que els dos agents d'amuntegament estaven distribuïts uniformement entre les mostres, sense mostrar ni segregació ni associació (figura suplementària 1d).Més aviat, suggereix que en aquest sistema promouen la separació de fases mitjançant efectes d'aglomeració macromolecular, ja que el PEG és un agent d'aglomeració preferentment estable, com es veu en altres sistemes LLP33,34.Aquestes gotes riques en proteïnes eren sensibles a NaCl (1 M), però no a 1,6-HD (10% v / v), confirmant les seves propietats electrostàtiques (figura suplementària 2a, b).El seu comportament fluid es va confirmar observant esdeveniments de gotetes de fusió de mil·lisegons mitjançant microscòpia BF (Fig. 2b).
a Imatges de microscòpia confocal (CF) d'αS/Tau441 coacerva en tampó LLPS (10 μM de cada proteïna, 0,5 μM d'αS marcat amb AF488 i Tau441 marcat amb Atto647N).b Imatges representatives de contrast d'interferència diferencial (DIC) d'esdeveniments de fusió de gotes αS/Tau441 (10 μM per cada proteïna).c Diagrama de fases basat en la dispersió de la llum (a 350 nm) de Tau441 LLPS (0–15 µM) en absència (esquerra) o presència (dreta) de 50 µM αS.Els colors més càlids indiquen més dispersió.d Dispersió de llum de mostres de αS/Tau441 LLPS amb concentració creixent d'αS (Tau441 a 5 µM, N = 2-3 repeticions de mostres tal com s'indica).e Representació esquemàtica d'algunes variants de proteïna tau i diferents regions de la proteïna utilitzada en aquest estudi: domini N-terminal carregat negativament (vermell), regió rica en prolina (blau), domini d'unió a microtúbuls (MTBD, ressaltat en taronja) i parell formador d'amiloide en espiral.regions de filaments (PHF) situades dins del MTBD (gris).Es mostra el mapa Net Charge Per Residue (NCPR) de Tau441.f Utilitzant αS marcat amb AF488 1 µM i ΔNt- marcat amb Atto647N, utilitzant αS o ΔCt-αS marcats amb AF488 1 µM en presència de ΔNt-Tau (superior, 10 µM per proteïna) o K18 (inferior, µM). ) ) ) micrografies de WF condensades en tampó LLPS o K18.Les barres d'escala d'una imatge representen l'escala de totes les imatges d'un plafó (20 µm per als panells a, b i f).Les dades en brut dels panells c i d es proporcionen com a fitxers de dades en brut.
Per provar el paper de αS en aquest procés LLPS, primer vam investigar l'efecte de αS sobre l'estabilitat de les gotes mitjançant nefelometria mitjançant concentracions creixents de NaCl (Fig. 2c).Com més gran sigui la concentració de sal a les mostres que contenen αS, més alts són els valors de dispersió de la llum (a 350 nm), cosa que indica el paper estabilitzador de αS en aquest sistema LLPS.Es pot observar un efecte similar augmentant la concentració d'αS (i, per tant, la relació αS:Tau441) a aprox.Augment de 10 vegades en relació a la concentració de tau (5 µM) (Fig. 2d).Per demostrar que αS és una proteïna de bastida en coacervats, vam decidir investigar el comportament del mutant Tau alterat per LLPS, que no té una regió N-terminal carregada negativament (residus 1-150, vegeu la figura 2e) anomenada ΔNt-Tau.La microscòpia i la nefelometria WF van confirmar que el mateix ΔNt-Tau no va patir LLPS (Fig. 2f i Fig. 2d suplementària), tal com es va informar anteriorment 14. Tanmateix, quan es va afegir αS a les solucions de dispersió d'aquesta variant de Tau truncada, el procés LLPS va ser completament. restaurat amb una densitat de gotetes propera a la densitat de gotetes de solucions de mida completa de Tau i αS en condicions i concentracions de proteïnes similars.Aquest procés també es pot observar en condicions de baixa aglomeració macromolecular (figura suplementària 2c).El paper de la regió αS C-terminal, però no tota la seva longitud, en el procés LLPS es va demostrar mitjançant la inhibició de la formació de gotetes mitjançant una variant αS truncada C-terminal sense residus 104-140 (Fig. 1a) del (ΔCt-). proteïna αS) (Fig. 2f i Fig. 2d suplementària).La colocalització de αS i ΔNt-Tau es va confirmar mitjançant microscòpia de fluorescència confocal (figura suplementària 1b).
Per provar encara més el mecanisme LLPS entre Tau441 i αS, es va utilitzar una variant addicional de Tau, és a dir, el fragment de nucli de filament helicoïdal aparellat (PHF) al domini d'unió a microtúbuls (MTBD), que si conté quatre dominis de repetició característics, comunament també coneguts. com el fragment K18 (vegeu la figura 2e).Recentment s'ha informat que αS s'uneix preferentment a una proteïna tau situada en un domini ric en prolina en una seqüència que precedeix el domini d'unió als microtúbuls.Tanmateix, la regió PHF també és rica en residus carregats positivament (vegeu la figura 2e), especialment la lisina (15% de residus), cosa que ens va impulsar a provar si aquesta regió també contribueix a la condensació del complex αS/Tau.Vam observar que K18 sol no podia activar LLPS a concentracions de fins a 100 μM en les condicions provades (tampó LLPS amb 15% PEG o 20% dextran) (Figura 2f).Tanmateix, quan vam afegir 50 µM αS a 50 µM K18, es va observar la formació ràpida de gotes de proteïnes que contenien K18 i αS mitjançant nefelometria (figura suplementària 2d) i microscòpia WF (Fig. 2f).Com era d'esperar, ΔCt-αS no va poder restaurar el comportament LLPS de K18 (Fig. 2f).Observem que l'agregació αS/K18 requereix concentracions de proteïnes lleugerament més elevades per induir LLPS en comparació amb αS/ΔNt-Tau o αS/Tau441, amb la resta de coses iguals.Això és coherent amb una interacció més forta de la regió C-terminal αS amb el domini Tau ric en prolina en comparació amb el domini d'unió a microtúbuls, tal com es va descriure anteriorment 31 .
Atès que ΔNt-Tau no pot realitzar LLPS en absència de αS, vam triar aquesta variant Tau com a model per caracteritzar αS/Tau LLPS donada la seva simplicitat en sistemes LLPS amb Tau de longitud completa (isotip, Tau441/Tau441).amb processos d'agregació complexos (heterotípics, αS/Tau441).Hem comparat el grau d'agregació αS (com a part de la proteïna de la fase condensada, fαS,c) als sistemes αS/Tau i αS/ΔNt-Tau mitjançant centrifugació i anàlisi SDS-PAGE en fase dispersa (vegeu 2e), vam trobar valors molt similars. per a totes les proteïnes a la mateixa concentració.En particular, vam obtenir fαS, c 84 ± 2% i 79 ± 7% per a αS/Tau i αS/ΔNt-Tau, respectivament, cosa que suggereix que la interacció heterotípica entre αS i tau és superior a la interacció entre molècules tau.entre.
La interacció amb diversos policats i l'efecte del procés de condensació sobre la cinètica αS es van estudiar per primera vegada mitjançant el mètode de recuperació de fluorescència després del fotoblanqueig (FRAP).Hem provat els coacervats αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau i αS/pLK (100 μM αS complementat amb 2 μM αS AF488-αS i 100 μM Tau441 o ΔNt-Tau o 1 mM pLK).Les dades es van obtenir durant els primers 30 minuts després de barrejar els components de la mostra.A partir d'imatges FRAP representatives (Fig. 3a, condensació αS/Tau441) i les seves corresponents corbes de curs de temps (Fig. 3b, Fig. 3 suplementària), es pot veure que la cinètica αS és molt similar a la dels coacervats Tau441.i ΔNt-Tau, que és molt més ràpid amb pLK.Els coeficients de difusió calculats per a αS dins del coacervat segons FRAP (tal com el descriuen Kang et al. 35) són D = 0,013 ± 0,009 µm2/s i D = 0,026 ± 0,008 µm2/s per a αS/Tau441 i αNt-S per/Δ el sistema αS/.pLK, Tau i D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, respectivament (Fig. 3c).Tanmateix, el coeficient de difusió αS a la fase dispersa és diversos ordres de magnitud superior a totes les fases condensades, tal com es determina mitjançant l'espectroscòpia de correlació de fluorescència (FCS, vegeu la figura suplementària 3) en les mateixes condicions (tampó LLPS), però en absència de polications. (D = 8 ± 4 µm2/s).Per tant, la cinètica de la traducció d'αS es redueix significativament en els coacervats en comparació amb les proteïnes en la fase dispersa a causa dels efectes d'amuntegament molecular pronunciats, tot i que tots els coacervats conserven propietats semblants al líquid durant la primera mitja hora després de la seva formació, en contrast amb la fase tau.cinètica més ràpida en el condensat pLK.
Anàlisi a–c FRAP de la dinàmica αS (2% αS marcat amb AF488) en coacervats electrostàtics.A (a) es mostren imatges representatives dels assajos αS/Tau441 FRAP per triplicat, on els cercles vermells indiquen àrees decolorides.La barra d'escala és de 5 µm.b Corbes mitjanes de FRAP i (c) coeficients de difusió calculats (D) per a 5–6 (N) gotes diferents de tres experiments amb 100 µM αS i concentracions equimolars de Tau441 (vermell) o ΔNt-Tau (blau) o pLK (verd) a deu vegades la concentració de LLPS.La desviació estàndard de la corba FRAP es mostra en color ombrejat.Per comparar, es va determinar el coeficient de difusió αS a la fase dispersa per triplicat mitjançant l'espectroscòpia de correlació de fluorescència (FCS) (vegeu la figura suplementària 3 i els mètodes per obtenir més informació).d Espectres continus EPR de banda X de 100 μM TEMPOL-122-αS en tampó LLPS sense cap policatió (negre) o en presència de 100 μM Tau441 (vermell) o ΔNt-Tau (blau) o 1 mM pLK (verd).El requadre mostra una visió ampliada de les línies de camp fortes on es produeixen els canvis més dramàtics.e Corbes d'unió de 50 μM TEMPOL-122-αS amb diversos polications en absència de LLPS (sense PEG).Es demostra que l'amplitud reduïda de la banda III en comparació amb la banda II (IIII/III) de l'espectre EPR normalitzat augmenta les relacions molars de Tau441 (vermell), ΔNt-Tau (blau) i pLK (verd).Les línies de colors mostren l'ajust a les dades mitjançant un model d'enllaç aproximat amb n llocs d'unió idèntics i independents a cada corba.Les dades en brut es proporcionen en forma de fitxers de dades en brut.
Com a complement, vam investigar la dinàmica d'αS en diversos coacervats mitjançant l'etiquetatge de spin dirigit (SDSL) i la ressonància paramagnètica d'electrons contínua (CW-EPR).Aquest mètode ha demostrat ser molt útil per informar de la flexibilitat i la dinàmica de l'IDP amb una resolució residual realista36,37,38.Amb aquesta finalitat, vam construir residus de cisteïna en mutants Cys únics i vam utilitzar la sonda de spin 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-oxyl (TEMPOL).Els derivats de la maleimida els marquen.Més concretament, hem inserit sondes TEMPOL a la posició 122 o 24 αS (TEMPOL-122-αS i TEMPOL-24-αS).En el primer cas, ens dirigim a la regió C-terminal de la proteïna, que està implicada en la interacció amb polications.En canvi, la posició 24 ens pot donar informació sobre la dinàmica global de les proteïnes del condensat.En ambdós casos, els senyals EPR obtinguts per a proteïnes de la fase dispersa corresponien a radicals de nitròxid en estat de moviment ràpid.Després de la separació de fases en presència de tau o pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 o ΔNt-Tau en una proporció d'1:1 o pLK en una proporció d'1:10), es va observar un augment de la intensitat màxima relativa a l'espectre EPR d'αS.La línia de pèrdua es va eixamplar, cosa que indica una cinètica de reorientació αS reduïda en gotes en comparació amb la proteïna en fase diluïda (figura 3d, figura suplementària 4a).Aquests canvis són més pronunciats a la posició 122. Mentre que a la posició 24 la presència de pLK no va afectar la cinètica de la sonda, a la posició 122 la forma de la línia espectral va canviar significativament (figura suplementària 4a).Quan vam intentar modelar els espectres a la posició 122 de dos sistemes αS/policació mitjançant el model isotròpic (figura suplementària 5a) que s'utilitza habitualment per descriure la dinàmica de l'IDP38,39 marcat amb spin, no vam poder reconstruir els espectres experimentals..Simulació espectral de la posició de contrastos de 24 girs (figura suplementària 5a).Això suggereix que hi ha posicions preferents a l'espai de configuracions de spin de la regió C-terminal d'αS en presència de polications.Quan es considera la fracció d'αS a la fase condensada en condicions experimentals d'EPR (84 ± 2%, 79 ± 7% i 47 ± 4% per a αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau i αS/pLK, respectivament, vegeu Suplementari). Fig. 2e de l'anàlisi de dades c), es pot veure que l'ampliació detectada pel mètode EPR reflecteix principalment la interacció de la regió C-terminal d'αS amb diversos polications en la fase condensada (el canvi principal quan s'utilitza TEMPOL-122-). αS), i no condensació de proteïnes.S'observa un augment de la microviscositat a la sonda.Com era d'esperar, l'espectre EPR de la proteïna en condicions diferents de LLPS es va restaurar completament quan es va afegir NaCl 1 M a la barreja (figura suplementària 4b).En general, les nostres dades suggereixen que els canvis detectats per CW-EPR reflecteixen principalment la interacció de la regió C-terminal de αS amb diversos policats en la fase condensada, i aquesta interacció sembla ser més forta amb pLK que amb Tau.
Per obtenir més informació estructural sobre les proteïnes del coacervat, vam decidir estudiar el sistema LLPS mitjançant RMN en solució.Tanmateix, només vam poder detectar la fracció αS que queda en la fase dispersa, cosa que pot ser deguda a una dinàmica de proteïnes reduïda dins del coacervat i una fase densa a la part inferior de la solució en l'anàlisi de RMN.Quan vam analitzar l'estructura i la dinàmica de la proteïna que quedava a la fase dispersa de la mostra LLPS mitjançant RMN (figura suplementària 5c, d), ens vam adonar que la proteïna es comportava gairebé de manera idèntica en presència de pLK i ΔNt-Tau, tots dos que es trobaven en l'estructura secundària i la dinàmica de la columna vertebral de la proteïna, revelada per experiments sobre desplaçament químic secundari i relaxació R1ρ.Les dades de RMN mostren que l'extrem C-terminal de αS pateix una pèrdua important de flexibilitat conformacional mentre conserva la seva naturalesa desordenada, com la resta de la seqüència de proteïnes, a causa de les seves interaccions amb polications.
Atès que l'ampliació del senyal CW-EPR observada a la fase condensada TEMPOL-122-αS reflecteix la interacció de la proteïna amb polications, vam realitzar una titulació EPR per avaluar l'afinitat d'unió de αS a diversos polications en absència de LLPS (sense acumulació de Buffer LLPS), cosa que suggereix que les interaccions són les mateixes en fases diluïdes i concentrades (cosa que es confirma amb les nostres dades, figura suplementària 4a i figura suplementària 6).L'objectiu era veure si tots els coacervats, malgrat les seves propietats comunes semblants a un fluid, presenten algun comportament diferencial subjacent a nivell molecular.Com era d'esperar, l'espectre EPR es va ampliar amb l'augment de la concentració de policats, reflectint una disminució de la flexibilitat molecular a causa de les interaccions moleculars de tots els socis d'interacció gairebé fins a la saturació (figura 3e, figura suplementària 6).pLK va aconseguir aquesta saturació amb una proporció molar més baixa (polication: αS) en comparació amb ΔNt-Tau i Tau441.De fet, la comparació de les dades amb un model d'unió aproximat assumint n llocs d'unió idèntics i independents va mostrar que la constant de dissociació aparent de pLK (~ 5 μM) és un ordre de magnitud inferior a la de Tau441 o ΔNt-Tau (~ 50 μM). ).µM).Tot i que aquesta és una estimació aproximada, això suggereix que αS té una afinitat més alta per polications més simples amb regions de càrrega positiva contínua.Tenint en compte aquesta diferència d'afinitat entre αS i diversos polications, vam plantejar la hipòtesi que les seves propietats líquides poden canviar de manera diferent al llarg del temps i, per tant, patir diferents processos LSPT.
Donat l'entorn molt concorregut dins del coacervat de proteïnes i la naturalesa amiloide de la proteïna, vam observar el comportament del coacervat al llarg del temps per detectar possibles processos LSPT.Utilitzant la microscòpia BF i CF (figura 4), vam observar que αS / Tau441 coacerva en gran mesura en solució, formant gotes grans que contacten i mullen la superfície a la part inferior del pou / tobogan com a gotes plenes, com s'esperava (figura suplementària). .7d);anomenem "basses de proteïnes" a aquestes estructures de fons.Aquestes estructures es van mantenir fluides, ja que conservaven la capacitat de fusionar-se (figura suplementària 7b) i es van poder veure durant diverses hores després de l'activació del LLPS (figura 4 i figura suplementària 7c).Vam observar que el procés de humectació es veu afavorit a la superfície de materials hidròfils en lloc de hidròfobs (figura suplementària 7a), com s'esperava per als coacervats electrostàtics amb càrregues desequilibrades i, per tant, potencials superficials electrostàtics elevats.En particular, la coalescència αS/ΔNt-Tau i el ràfting es van reduir significativament, mentre que els condensats αS/pLK es van reduir significativament (Fig. 4).Durant el curt temps d'incubació, les gotes de αS/pLK van poder unir-se i mullar la superfície hidròfila, però aquest procés es va aturar ràpidament i després de 5 hores d'incubació, només es van observar esdeveniments de coalescència limitats i no es van observar humectació.- Transició gel-goteig.
BF (panells en escala de grisos) i CF (panells de la dreta, αS marcat amb AF488 en verd) de mostres de coacervat que contenen 100 µM αS (1% etiqueta fluorescent) en tampó LLPS en presència d'imatges microscòpiques de 100 µM Tau441 (superior) fluorescència ΔN -Tau (centre) o 1 mM pLK (inferior) a diferents temps d'incubació i alçades focals (z, distància del fons del pou de la placa).Els experiments es van repetir 4-6 vegades independentment els uns dels altres amb els mateixos resultats.Els coacervats αS/Tau441 es mullen després de 24 hores, formant basses més grans que la imatge.La barra d'escala per a totes les imatges és de 20 µm.
A continuació, vam preguntar si els grans conjunts de proteïnes semblants a fluids formats a αS/Tau441 LLPS conduirien a l'agregació d'amiloide d'alguna de les proteïnes estudiades.Vam seguir la maduració de les gotes d'αS / Tau441 al llarg del temps amb microscòpia WF en les mateixes condicions que l'anterior, però utilitzant αS marcat amb AF488 1 μM i Tau441 marcat amb Atto647N (Fig. 5a).Com era d'esperar, vam observar una localització completa de proteïnes durant tot el procés de maduració.Curiosament, des de ca.Passades 5 hores es van observar estructures no circulars més intenses a l'interior de les basses, que vam anomenar “punts”, algunes de les quals estaven colocalitzades amb αS, i algunes s'enriquien en Tau441 (Fig. 5a, fletxes blanques).Aquestes taques sempre s'han observat dins de les basses en major mesura per a αS/ΔNt-Tau que per a αS/ΔNt-Tau.No hi havia taques diferents a les gotes dels sistemes pLK i Tau incompetents per a la fusió / humectació.Per provar si aquestes taques que contenen αS i Tau441 són agregats semblants a l'amiloide, vam realitzar un experiment similar mitjançant microscòpia CF en què Tau441 es va etiquetar amb Atto647N i es va afegir 12, 5 μM de tioflavina-T específica d'amiloide (ThT) des del principi.tint.Tot i que la tinció de ThT de les gotes o les basses αS/Tau441 no es va observar fins i tot després de 24 h d'incubació (Fig. 5b, fila superior: gotes restants sobre les basses de proteïnes), les estructures ThT positives que contenien Atto647N-Tau441 dins de les basses eren molt febles.això replica la mida, la forma i la ubicació de les taques descrites anteriorment (Fig. 5b, files mitjanes i inferiors), cosa que suggereix que les taques poden correspondre a agregats semblants a l'amiloide formats en coacervats de fluids envellits.
WF 25 μM αS a diversos temps d'incubació i altures focals (z, distància des del fons no lligat) en presència de 25 μM Tau441 (1 μM AF488-etiquetat αS i Atto647N-etiquetat Tau441) en un pou d'una placa de microscopi amb tampó LLPS) .Es van repetir de manera independent sis experiments amb resultats similars.b Imatge microscòpica CF de 25 μM αS en presència de 25 μM Tau441 (1 μM Tau441 marcat amb Atto647N) i 12,5 μM de tioflavina-T (ThT).Les gotes de proteïna ponderades i les basses i taques de proteïnes dipositades es mostren a les files superior i mitjana, respectivament.La fila inferior mostra imatges de basses i gotes de 3 rèpliques independents.Les fletxes blanques indiquen punts ThT-positius als dos panells.La barra d'escala per a totes les imatges és de 20 µm.
Per examinar amb més detall els canvis en la xarxa de proteïnes coacervats durant la transició de líquid a sòlid, hem utilitzat imatges de fluorescència de vida útil (FLIM) i microscòpia de transferència d'energia de ressonància de Förster (FRET) (figura 6 i figures suplementàries 8 i 9).Vam plantejar la hipòtesi que la maduració del coacervat de la capa en una estructura de proteïna agregada més condensada o fins i tot sòlida condueix a un contacte més estret entre la proteïna i la sonda fluorescent connectada a ella, produint potencialment un efecte d'extinció manifestat en una vida útil de la sonda escurçada (τ) , tal com s'ha descrit anteriorment40.,41 ,42.A més, per a mostres amb doble etiqueta (AF488 i Atto647N com a colorants donants i acceptors de FRET, respectivament), aquesta disminució de τ també pot anar acompanyada de condensació de coacervats i un augment de l'eficiència de FRET (E) durant LSPT.Es va controlar la formació de bassa i taques al llarg del temps en mostres LLPS αS/Tau441 i αS/ΔNt-Tau (25 µM de cada proteïna al tampó LLPS que contenia 1 µM AF488 marcat amb αS i/o Atto647N marcat amb Tau441 o ΔNt-Tau).Vam observar una tendència general en què la vida útil de la fluorescència de les sondes AF488 (τ488) i Atto647N (τ647N) va disminuir lleugerament a mesura que maduraven els coacervats (Fig. 6 i Fig. 8c suplementària).Curiosament, aquest canvi es va millorar significativament per als punts dins de les basses (Fig. 6c), cosa que indica que es va produir més condensació de proteïnes als punts.En suport d'això, no es va observar cap canvi significatiu en la vida útil de la fluorescència per a les gotes de αS/ΔNt-Tau envellides durant 24 h (figura suplementària 8d), cosa que suggereix que la gelificació de gotes és un procés diferent de la taca i que no va acompanyada d'una reorganització molecular significativa. dins dels coacervats.Cal tenir en compte que els punts tenen diferents mides i contingut variable en αS, especialment per al sistema αS/Tau441 (figura suplementària 8e).La disminució de la vida útil de la fluorescència puntual va anar acompanyada d'un augment de la intensitat, especialment per a Atto647N etiquetat amb Tau441 (figura suplementària 8a) i eficiències més elevades de FRET tant per als sistemes αS/Tau441 com αS/ΔNt-Tau, cosa que indica una condensació addicional en LLPS Cinc hores després de l'activació, les proteïnes dins de l'electricitat estàtica es van condensar.En comparació amb αS/ΔNt-Tau, vam observar valors τ647N més baixos i τ488 una mica més alts en punts αS/Tau441, acompanyats de valors FRET més baixos i més no homogenis.Possiblement, això pot estar relacionat amb el fet que en el sistema αS/Tau441, l'abundància αS observada i esperada en els agregats és més heterogènia, sovint subestequiomètrica en comparació amb Tau, ja que el mateix Tau441 també pot patir LLPS i agregació (figura suplementària 8e) .Tanmateix, el grau de coalescència de gotetes, formació de bassa i, sobretot, agregació de proteïnes dins de coacervats semblants a líquids és màxim quan hi ha Tau441 i αS.
a Imatges de microscòpia de fluorescència de tota la vida (FLIM) d'αS/Tau441 i αS/ΔNt-Tau a 25 μM de cada proteïna (αS marcat amb AF488 1 μM i Tau441 o tampó ΔLLPS-Tau 1 μM marcat amb Atto647N).Les columnes mostren imatges representatives de mostres de LLPS en diferents temps de maduració (30 min, 5 h i 24 h).El marc vermell mostra la regió que conté taques αS/Tau441.La vida útil es mostra com a barres de color.Barra d'escala = 20 µm per a totes les imatges.b Imatge FLIM ampliada de l'àrea seleccionada, que es mostra al quadre vermell del tauler a.Els intervals de vida es mostren amb la mateixa escala de colors que al panell a.Barra d'escala = 5 µm.c Histogrames que mostren AF488 (adjuntat a αS) o Atto647N (adjuntat a Tau) per a diferents espècies de proteïnes (gotes-D-, raft-R- i speckle-P) identificades a les imatges FLIM enregistrades per a αS-) la vida útil de les distribucions de temps de Tau441 i Mostres de coacervat αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI per a D, 29-44 ROI per a R i 21-51 ROI per a punts).Els valors mitjans i mitjans es mostren com a quadrats grocs i línies negres dins de caixes, respectivament.Els límits inferior i superior de la caixa representen el primer i tercer quartils, respectivament, i els valors mínims i màxims dins del rang interquartil d'1,5 vegades (IQR) es mostren com a bigotis.Els valors atípics es mostren com a diamants negres.La significació estadística entre parells de distribucions es va determinar mitjançant una prova t de dues mostres, assumint variàncies desiguals.Els valors p de la prova t de dues cues es mostren amb asteriscs per a cada parell de dades comparades (* valor p > 0,01, ** valor p > 0,001, *** valor p > 0,0001, **** valor p > 0,00001), ns Indica negligibilitat (valor p > 0,05).Els valors p exactes es donen a la taula suplementària 1 i les dades originals es presenten com a fitxers de dades en brut.
Per demostrar encara més la naturalesa amiloide de les taques / agregats, vam tractar mostres de coacervats sense tacar durant 24 hores amb altes concentracions de NaCl (1 M), cosa que va donar lloc a la separació dels agregats dels coacervats de proteïnes.Quan es van observar agregats aïllats (és a dir, una solució dispersa d'agregats) mitjançant microscòpia de força atòmica (AFM), es va observar una morfologia predominantment esfèrica amb una alçada regular d'uns 15 nm, que tendeix a associar-se en condicions d'alta concentració de sal, similar a la el comportament de les fibril·les amiloides típiques a causa del fort efecte hidròfob a la superfície (tingueu en compte que les fibrilles solen tenir una alçada de ~ 10 nm) (figura suplementària 10a).Curiosament, quan es van incubar agregats aïllats amb ThT en un assaig estàndard de fluorescència ThT, vam observar un augment espectacular del rendiment quàntic de fluorescència ThT, comparable al observat quan el colorant es va incubar amb fibrils amiloides αS típiques (figura suplementària 10b), cosa que suggereix que els agregats coacervats contenen estructures semblants a l'amiloide..De fet, els agregats eren tolerants a altes concentracions de sal però sensibles al clorur de guanidina 4 M (GdnHCl), com les fibril·les amiloides típiques (figura suplementària 10c).
A continuació, es va analitzar la composició dels agregats mitjançant fluorescència d'una sola molècula, espectroscòpia de correlació/correlació creuada de fluorescència específica (FCS/FCCS) i anàlisi d'explosió de detecció de coincidència de dos colors (TCCD).Amb aquesta finalitat, vam aïllar els agregats formats després de 24 hores d'incubació en mostres de 100 μl de LLPS que contenien αS i Tau441 (tots dos de 25 μM) juntament amb 1 μM d'αS marcat amb AF488 i 1 μM de Tau441 marcat amb Atto647N.Diluïu la solució agregada dispersa resultant a un estat monomolecular utilitzant el mateix tampó lliure de PEG i NaCl 1 M (el mateix tampó utilitzat per separar els agregats del coacervat) per evitar possibles interaccions electrostàtiques entre LLPS i proteïnes.A la figura 7a es pot veure un exemple de la trajectòria temporal d'una sola molècula.L'anàlisi FCCS/FCS (correlació creuada, CC i autocorrelació, AC) va mostrar que els agregats que contenien αS i tau eren abundants a les mostres (vegeu la corba CC a la figura 7b, panell esquerre) i va sorgir un excés de proteïna monomèrica residual com a resultat del procés de dilució (vegeu les corbes de CA a la figura 7b, panell esquerre).Els experiments de control realitzats en les mateixes condicions de solució utilitzant mostres que contenien només proteïnes monomèriques no van mostrar corbes CC, i les corbes AC encaixen bé amb el model de difusió d'un component (Eq. 4), on les proteïnes monomèriques tenen els coeficients de difusió esperats (Fig. 7b). ), panell dret).El coeficient de difusió de les partícules agregades és inferior a 1 µm2/s, i el de les proteïnes monomèriques és d'uns 1 µm2/s.50–100 µm/s;els valors són similars als valors publicats anteriorment per a fibril·les amiloides αS sonicats i αS monomèrics per separat en condicions de solució similars44.Quan vam analitzar els agregats amb l'anàlisi d'explosió TCCD (Fig. 7c, panell superior), vam trobar que en cada agregat aïllat (heteroagregat αS/Tau), al voltant del 60% dels agregats detectats contenien tant αS com tau, al voltant del 30% només contenien tau, només un 10% αS.L'anàlisi estequiomètrica dels heteroagregats αS/Tau va mostrar que la majoria dels heteroagregats estaven enriquits en tau (estequiometria per sota de 0,5, el nombre mitjà de molècules de tau per agregat és 4 vegades més que les molècules αS), cosa que és coherent amb el nostre treball observat a FLIM in situ. experiments..L'anàlisi FRET va demostrar que aquests agregats contenien ambdues proteïnes, tot i que els valors reals de FRET en aquest cas no són de gran importància, ja que la distribució de fluoròfors en cada agregat era aleatòria a causa d'un excés de proteïna no marcada utilitzada en l'experiment.Curiosament, quan vam realitzar la mateixa anàlisi utilitzant la variant Tau amb deficiència d'agregació amiloide madura de 45,46 (vegeu la figura suplementària 11a, b), vam observar que, tot i que l'agregació electrostàtica αS era la mateixa (figura suplementària 11c, d), la capacitat de formar agregats dins del coacervat es va reduir dràsticament i FLIM va detectar diversos punts en experiments in situ, i es van observar corbes de correlació creuada febles per a mostres agregades aïllades.No obstant això, per a un nombre reduït d'agregats detectats (només una desena part de Tau441), vam observar que cada agregat estava enriquit en αS que aquesta variant Tau, amb aproximadament el 50% dels agregats detectats que contenien només molècules αS, i αS era heterogeni en excés. .agregats (vegeu la figura 11e suplementària), en contrast amb els agregats heterogenis generats per Tau441 (figura 6f).Els resultats d'aquests experiments van demostrar que, tot i que el propi αS és capaç d'acumular-se amb tau dins del coacervat, la nucleació de tau és més favorable en aquestes condicions, i els agregats semblants a l'amiloide resultants poden actuar com una forma de αS i tau.Tanmateix, una vegada que es forma un nucli ric en tau, les interaccions heterotípiques entre αS i tau es veuen afavorides en els agregats sobre les interaccions homotípiques entre les molècules de tau;també observem xarxes de proteïnes en coacervats líquids αS/tau.
a Traces temporals de fluorescència representatives de molècules individuals d'agregats aïllats formades en coacervats electrostàtics αS/Tau441.Es van observar ràfegues corresponents a coagregats αS/Tau441 (esclats per sobre del llindar indicat) en tres canals de detecció (emissió AF488 i Atto647N després de l'excitació directa, línies blaves i vermelles, emissió Atto647N després de l'excitació indirecta), FRET, línia violeta).b Anàlisi FCS/FCCS d'una mostra d'agregats αS/Tau441 aïllats obtinguts a partir de LLPS (tauler esquerre).Les corbes d'autocorrelació (AC) per a AF488 i Atto647N es mostren en blau i vermell, respectivament, i les corbes de correlació creuada (CC) associades amb agregats que contenen ambdós colorants es mostren en violeta.Les corbes AC reflecteixen la presència d'espècies proteiques monomèriques i agregades marcades, mentre que les corbes CC mostren només la difusió d'agregats doblement marcats.La mateixa anàlisi, però en les mateixes condicions de solució que en punts aïllats, es mostren mostres que només contenen αS i Tau441 monomèrics com a controls al tauler dret.c Anàlisi flaix de fluorescència de molècules individuals d'agregats aïllats formats en coacervats electrostàtics αS/Tau441.La informació de cada agregat que es troba en quatre repeticions diferents (N = 152) es representa en funció de la seva estequiometria, valors S i eficiència FRET (el panell superior, la barra de color reflecteix l'ocurrència).Es poden distingir tres tipus d'agregats: -agregats només αS amb S~1 i FRET~0, agregats només Tau amb S~0 i FRET~1 i agregats heterogenis Tau/αS amb S i FRET intermedis Estimacions de la quantitat de les dues proteïnes marcadores detectades en cada agregat heterogeni (N = 100) es mostren al panell inferior (l'escala de color reflecteix l'ocurrència).Les dades en brut es proporcionen en forma de fitxers de dades en brut.
S'ha informat que la maduració o l'envelliment dels condensats de proteïnes líquides en estructures semblants a gel o sòlides al llarg del temps s'ha informat que està implicada en diverses funcions fisiològiques del condensat47 així com en la malaltia, com a procés anormal que precedeix l'agregació amiloide 7, 48, 49. Aquí estudiem detalladament la separació de fases i el comportament.LSPT αS en presència de polications aleatoris en un entorn controlat a baixes concentracions micromolars i condicions fisiològicament rellevants (tingueu en compte que la concentració fisiològica calculada d'αS és > 1 µM50), seguint el comportament termodinàmic típic de LPS.Hem trobat que αS, que conté una regió C-terminal altament carregada negativament a pH fisiològic, és capaç de formar gotes riques en proteïnes en solució aquosa mitjançant LLPS en presència de pèptids desordenats altament catiònics com pLK o Tau mitjançant el procés d'electrostàtica. condensació complexa en presència de macromolècules d'agregació.Aquest procés pot tenir efectes rellevants en l'entorn cel·lular on αS es troba amb diverses molècules policatiniques associades a la seva agregació associada a la malaltia tant in vitro com in vivo51,52,53,54.
En molts estudis, la dinàmica de proteïnes dins de les gotes s'ha considerat com un dels factors clau que determina el procés de maduració55,56.En els coacervats electrostàtics de αS amb polications, el procés de maduració aparentment depèn de la força de les interaccions amb els polications, la valència i la multiplicitat d'aquestes interaccions.La teoria de l'equilibri suggereix que un paisatge d'equilibri de dos estats líquids seria la presència d'una gran gota rica en biopolímers que impulsen LLPS57,58.El creixement de les gotes es pot aconseguir mitjançant la maduració d'Ostwald59, la coalescència60 o el consum de monòmer lliure en la fase dispersa61.Per a αS i Tau441, ΔNt-Tau o pLK, la major part de la proteïna es va concentrar al condensat en les condicions utilitzades en aquest estudi.No obstant això, mentre que les gotes de tau de mida completa es van unir ràpidament amb la humectació de la superfície, la coalescència i la humectació de les gotes van ser difícils per a ΔNt-Tau i pLK, cosa que suggereix una pèrdua ràpida de propietats líquides en aquests dos sistemes.Segons la nostra anàlisi FLIM-FRET, les gotes de pLK i ΔNt-Tau envellides van mostrar un grau similar d'agregació de proteïnes (durada de vida de fluorescència similar) que les gotes originals, cosa que suggereix que la xarxa de proteïnes original es va mantenir, encara que més rígida.
Racionalitzem els nostres resultats experimentals en el model següent (Figura 8).Les gotes formades temporalment inicialment són sovint xarxes de proteïnes sense compensació electrostàtica i, per tant, hi ha àrees de desequilibri de càrrega, especialment a la interfície de la gota, donant lloc a gotes amb un potencial de superfície electrostàtica elevat.Per compensar la càrrega (un fenomen conegut com a esgotament de valència) i minimitzar el potencial superficial de les gotes, les gotes poden incloure nous polipèptids de la fase diluïda, reorganitzar les xarxes de proteïnes per optimitzar les interaccions càrrega-càrrega i interactuar amb altres gotes.amb superfícies (humitat).Les gotes αS/pLK, a causa de la seva xarxa proteica més senzilla (només interaccions heterotípiques entre αS i pLK) i una major afinitat per les interaccions proteïna-proteïna, semblen ser capaces d'equilibrar la càrrega del condensat més ràpidament;de fet, vam observar una cinètica de proteïnes més ràpida en coacervats αS/pLK formats inicialment que en αS/Tau.Després de l'esgotament de la valència, les interaccions es tornen menys efímeres i les gotes perden les seves propietats líquides i es converteixen en gotes de gel, no inflamables amb un potencial superficial electrostàtic baix (i, per tant, no poden mullar la superfície).En canvi, les gotes αS/Tau són menys eficients per optimitzar l'equilibri de càrrega de les gotes a causa de xarxes de proteïnes més complexes (amb interaccions homotípiques i heterotípiques) i la naturalesa més feble de les interaccions de proteïnes.Això es tradueix en gotes que mantenen el comportament del líquid durant períodes prolongats de temps i presenten un alt potencial de superfície electrostàtica que tendeix a minimitzar-se mitjançant la coalescència i el creixement (minimitzant així la relació àrea de superfície / volum de les gotes) i humitejant la química superficial hidròfila.Això crea grans biblioteques de proteïnes concentrades que conserven les propietats del fluid, ja que les interaccions segueixen sent molt transitòries a causa de la recerca constant d'optimització de càrrega a la xarxa de proteïnes.Curiosament, les formes truncades N-terminals de Tau, incloses algunes isoformes naturals62, presenten un comportament intermedi, amb alguns coacervats que envelleixen amb αS en gotes de gel de llarga vida, mentre que altres es transformen en grans condensats líquids.Aquesta dualitat en la maduració dels coacervats electrostàtics αS és coherent amb els estudis teòrics i experimentals recents de LLPS que han identificat una correlació entre l'esgotament de la valència i el tamisatge electrostàtic en els condensats com a clau per controlar la mida del condensat i les propietats del fluid.Mecanisme 58.61.
Aquest esquema mostra la via d'agregació d'amiloide putativa per a αS i Tau441 mitjançant LLPS i LSPT.Amb regions addicionals riques en anions (vermell) i riques en cations (blau), els coacervats electrostàtics αS i tau amb valència satisfactòria tenen menor energia superficial i, per tant, menys coalescència, donant lloc a un ràpid envelliment de les gotes.S'aconsegueix un estat de gel no aglomerat estable..Aquesta situació és molt favorable en el cas del sistema αS/pLK a causa de la seva més gran afinitat i una xarxa d'interacció proteïna-parell més senzilla, que permet una ràpida transició semblant a un gel.Per contra, les gotes amb valència insatisfactòria i, per tant, regions carregades de proteïnes disponibles per a la interacció, faciliten que el coacervat fusioni i mulli la superfície hidròfila per tal de reduir la seva alta energia superficial.Aquesta situació és preferible per als coacervats αS/Tau441, que tenen una xarxa complexa multivalent formada per interaccions febles Tau-Tau i αS-Tau.Al seu torn, els coacervats més grans conservaran més fàcilment les seves propietats semblants a fluids, permetent que es produeixin altres interaccions proteïna a proteïna.Finalment, els agregats heterogenis amiloides que contenen tant αS com tau es formen dins del líquid coacervat, que poden estar relacionats amb els que es troben als cossos d'inclusió, que són els distintius de les malalties neurodegeneratives.
Les grans estructures semblants a fluids formades durant la maduració de αS/Tau441 amb un entorn proteic altament congestionat però dinàmic i, en menor mesura, els coacervats αS/ΔNt-Tau són reservoris ideals per a la nucleació de l'agregació de proteïnes.De fet, hem observat la formació d'agregats de proteïnes sòlides en aquest tipus de coacervats de proteïnes, que sovint contenen tant αS com tau.Hem demostrat que aquests heteroagregats s'estabilitzen mitjançant interaccions no electrostàtiques, són capaços d'unir colorants ThT específics d'amiloide de la mateixa manera que les fibrils amiloides típiques i, de fet, tenen una resistència similar a diverses influències.Es va demostrar que els agregats αS/tau formats per LLPS tenien propietats semblants a l'amiloide.De fet, la variant madura de Tau deficient en l'agregació d'amiloide es veu afectada significativament en la formació d'aquests agregats αS heterogenis dins del coacervat electrostàtic líquid.La formació d'agregats αS/Tau441 només es va observar a l'interior dels coacervats, que conservaven propietats semblants al líquid, i mai, si els coacervats/gotetes no arribaven a l'estat de gel.En aquest últim cas, l'augment de la força de les interaccions electrostàtiques i, com a resultat, la rigidesa de la xarxa de proteïnes impedeixen els necessaris reordenaments conformacionals de les proteïnes per establir noves interaccions proteiques necessàries per a la nucleació de l'amiloide.Tanmateix, això es pot aconseguir en coacervats més flexibles i semblants a líquids, que al seu torn tenen més probabilitats de romandre líquids a mesura que augmenten de mida.
El fet que la formació d'agregats dins de la fase condensada sigui preferible en grans condensats αS/Tau que en petites gotes que gelifiquen ràpidament, posa de manifest la rellevància d'identificar els factors que controlen la coalescència de les gotes.Així, no només hi ha una tendència a la separació de fases, sinó que s'ha de controlar la mida del condensat per a un bon funcionament així com per a la prevenció de malalties58,61.Els nostres resultats també destaquen la importància de l'equilibri entre LLPS i LSPT per al sistema αS/Tau.Tot i que la formació de gotetes pot protegir contra l'agregació d'amiloide reduint la quantitat de monòmers proteics disponibles en condicions de saturació, com s'ha proposat en altres sistemes63,64, la fusió de gotes a nivells elevats de gotetes pot conduir a l'agregació interna de proteïnes mitjançant reordenaments conformacionals lents.xarxes de proteïnes..
En general, les nostres dades emfatitzen fortament la rellevància de la valència cohesionada i les interaccions satisfets/insatisfets a les xarxes de caiguda en el context de LSPT.En particular, mostrem que els condensats αS/Tau441 de longitud completa són capaços de fusionar-se i nuclear-se de manera eficient per formar heteroagregats semblants a l'amiloide que inclouen ambdues proteïnes i proposen un mecanisme molecular basat en els nostres resultats experimentals.La co-agregació de dues proteïnes al coacervat del fluid αS/Tau que informem aquí pot estar relacionada amb la co-localització de dues proteïnes en inclusions, que són els distintius de la malaltia, i pot contribuir a entendre la relació entre LLPS i l'agregació amiloide, obrint el camí per a l'IDP altament carregat en la neurodegeneració.
WT-αS monomèrics, mutants de cisteïna (Q24C-αS, N122C-αS) i variants ΔCt-αS (Δ101-140) es van expressar a E. coli i es van purificar tal com es va descriure anteriorment.Es va incloure 5 mM DTT en tots els passos de la purificació de mutants de cisteïna αS per evitar la formació d'enllaços disulfur.La isoforma Tau441 (plàsmidi obtinguda a partir de Addgene #16316), la variant ΔNt-Tau (Δ1–150, obtinguda clonant IVA amb primers CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) i la variant AggDef-Tau-Creació purificada amb cultiu de G31TC, coli (ΔGCCACCGCGG) van ser variants purificades amb G31125. va créixer fins a OD600 = 0, 6–0, 7 a 37 ° C i 180 rpm, i es va induir l'expressió amb IPTG durant 3 hores a 37 ° C.Recolliu cèl·lules a 11.500 xg durant 15 min a 4 ° C i rentar-les amb tampó salí que conté NaCl 150 mM.Resuspendre el pellet al tampó de lisi (20 ml per 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidina 50 μM, copeptina μM100).El pas de sonicació es va realitzar sobre gel amb una amplitud del 80% durant 10 polsos (1 min encès, 1 min apagat).No supereu els 60 ml en una ecografia.Els lisats d'E. coli es van escalfar a 95 °C durant 20 minuts, després es van refredar amb gel i es van centrifugar a 127.000 xg durant 40 minuts.El sobrenedant clarificat es va aplicar a una membrana de 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Regne Unit) i es va dialitzar contra 4 L de tampó de diàlisi (MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM). , PMSF 0,1 mM) durant 10 hores.Es va equilibrar una columna d'intercanvi catiònic de 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, EUA) amb tampó d'equilibri (MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM, PMSF 0,1 mM).El lisat tau es va filtrar a través d'un filtre PVDF de 0, 22 μm i es va injectar a la columna a un cabal d'1 ml/min.L'elució es va realitzar gradualment, el tau es va eluir amb un tampó d'elució del 15-30% (MES 20 mM, pH 6, 8, NaCl 1 M, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM, PMSF 0,1 mM).Les fraccions es van analitzar mitjançant SDS-PAGE, i les fraccions que contenien una banda amb el pes molecular esperat de tau es van concentrar mitjançant un filtre de centrífuga de 10 kDa i es van substituir per un tampó que contenia HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM i DTT 2 mM per la concentració final de proteïnes va ser de 100 μM.A continuació, la solució de proteïnes es va passar per un filtre de PVDF de 0, 22 μm, es va congelar ràpidament i es va emmagatzemar a -80 ° C.La proteïna K18 va ser amablement proporcionada pel Prof. Alberto Boffi.La puresa de la preparació va ser > 95%, tal com va confirmar SDS-PAGE i MALDI-TOF/TOF.Es van marcar químicament diverses cisteïnes amb AlexaFluor488-maleimida (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA) o TEMPOL-maleimida (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canadà).es van confirmar per absorbància i MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau i K18 es van etiquetar amb residus de cisteïna nadius a les posicions 191 i 322 mitjançant Atto647N-maleimida (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Alemanya) seguint el mateix procediment.Els mapes de càrrega net per residu per a αS i Tau441 es van generar mitjançant CIDER66.
La poli-L-lisina sòlida (pLK DP 90-110 segons RMN del proveïdor, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, EUA) es va dissoldre en HEPES 10 mM, NaCl 100 mM, concentració de pH de 7,4 a 10 mM, procés sonicat durant 5 minuts en un bany maria d'ultrasons i emmagatzemar a -20 °C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, EUA) i FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, EUA) són solubles en aigua i estan àmpliament distribuïts en el tampó LLPS.La diàlisi elimina les sals contaminants.Després es van filtrar a través d'un filtre de xeringa amb una mida de porus de 0, 22 μm i es van calcular les seves concentracions mitjançant un refractòmetre (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, EUA).Les mostres de LLPS es van preparar a temperatura ambient en el següent ordre: es van barrejar tampó i extrusió i 1 mM de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP, Carbosynth, Compton, Regne Unit), 1 mM de 2,2,2,2-(Ethane-). 1, 2-diildinitril) àcid tetraacètic (EDTA, carboxinth) i una barreja d'inhibidor de proteasa a l'1% (PMSF 100 mM, benzimida 1 mM, leupeptina 5 μM).Després s'afegeixen αS i polications fusionats (opcions pLK o Tau).Per als experiments de sèries temporals de tioflavina-T (ThT, Carbosynth, Compton, Regne Unit), utilitzeu la concentració total de ThT per ser la meitat de la concentració d'αS.Barregeu les mostres suaument però a fons per assegurar-vos que siguin homogènies.La concentració de cada component variava d'experiment a experiment, tal com es descriu a la secció de resultats.L'azida es va utilitzar a una concentració del 0,02% (p/v) sempre que la durada de l'experiment superava les 4 hores.Per a totes les anàlisis que utilitzen mostres LLPS, deixeu que la barreja s'equilibri durant 5 minuts abans de l'anàlisi.Per a l'anàlisi de la dispersió de la llum, es van carregar 150 µl de mostres a microplaques de 96 pous no vinculants (µClear®, negre, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Àustria) i es van cobrir amb una pel·lícula adhesiva.Els LLP es van controlar mesurant l'absorbància a 350 nm al centre de la solució en un lector de plaques CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Alemanya).Els experiments es van realitzar per triplicat a 25 ° C i els errors es van calcular com a desviació estàndard de la mitjana.La fase diluïda es va quantificar mitjançant centrifugació de mostres i anàlisi de gel SDS-PAGE, i la fracció αS a les fases diluïda i concentrada es va quantificar en diverses solucions LLPS.Es va preparar una mostra de LLPS de 100 μl que contenia αS marcat amb AF488 1 μM mitjançant una barreja exhaustiva seguida de centrifugació a 9600 × g durant 30 minuts, després dels quals el precipitat normalment era visible.Els 50 μl superiors del sobrenedant es van utilitzar per a la quantificació de proteïnes mitjançant gel SDS-PAGE.Els gels es van escanejar amb filtres AF488 mitjançant un sistema d'imatge en gel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) o es van tacar amb una taca de Coomassie i es van visualitzar amb filtres adequats.Les bandes resultants es van analitzar mitjançant ImageJ versió 1.53i (National Institutes of Health, EUA).Els experiments es van dur a terme per duplicat en dos experiments diferents amb resultats similars.
Normalment, es van aplicar 150 μl de mostres a microplaques de 96 pous no vinculants i es van visualitzar a temperatura ambient en un microscopi invertit Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanya).Per a experiments puntuals, també es van utilitzar plaques d'angiogènesi µ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemanya) o microplaques de poliestirè de 96 pous (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Es van utilitzar làmpades halògenes EL6000 o d'halogenur metàl·lic de mercuri com a fonts d'il·luminació (per a imatges BF/DIC i WF, respectivament).Per a la microscòpia WF, es va utilitzar un objectiu d'aire amb augment de 40x (Leica Microsystems, Alemanya) per enfocar la llum a la mostra i recollir-la.Per a mostres marcades amb AF488 i ThT, filtre l'excitació i l'emissió amb conjunts de filtres GFP estàndard, filtres de pas de banda d'excitació i emissió, respectivament, filtres de pas de banda de 460-500 nm i 512-542 nm i un mirall dicroic de 495 nm.Per a les mostres etiquetades amb Atto647N, es va utilitzar un conjunt estàndard de filtres Cy5 amb filtres de pas de banda d'excitació i emissió de 628-40 nm i 692-40 nm, respectivament, i un mirall dicroic de 660 nm.Per a la microscòpia BF i DIC, utilitzeu el mateix objectiu de recollida de llum reflectida.La llum recollida es va gravar en una càmera CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Alemanya).El temps d'exposició va ser de 50 ms per a les imatges de microscòpia BF i DIC i de 20-100 ms per a les imatges de microscòpia WF.Per comparar, el temps d'exposició per a tots els experiments amb ThT va ser de 100 ms.Es van realitzar experiments de lapse de temps per visualitzar la coalescència de gotetes, amb imatges que es van recollir cada 100 ms durant diversos minuts.Per a l'anàlisi d'imatges es va utilitzar ImageJ (NIH, EUA).Els experiments es van dur a terme per triplicat amb resultats similars.
Per a experiments de colocalització, FRAP i reconstrucció 3D, es van adquirir imatges en un microscopi confocal invertit Zeiss LSM 880 mitjançant una edició blava ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemanya).Es van aplicar mostres de 50 µl a plaques de Petri d'angiogènesi µ-Slide (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Alemanya), tractades amb un polímer hidròfil (ibiTreat) i muntades en un objectiu d'immersió en oli de 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) al DIC).Les imatges es van adquirir mitjançant línies làser d'argó de 458 nm, 488 nm i 633 nm amb una resolució de 0,26 µm/píxel i un temps d'exposició de 8 µs/píxel per a finestres d'excitació i detecció d'emissions de 470-600 nm, 493-628 nm, i es van utilitzar 638–755 nm per visualitzar ThT, AF488 i Atto647N, respectivament.Per als experiments FRAP, es va registrar una fotografia en lapse de temps de cada mostra a 1 fotograma per segon.Els experiments es van dur a terme per triplicat a temperatura ambient amb resultats similars.Totes les imatges es van analitzar mitjançant el programari Zen 2 Blue Edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemanya).Les corbes FRAP es van normalitzar, es van dibuixar i es van ajustar a les dades d'intensitat/temps extretes d'imatges mitjançant Zen 2 mitjançant OriginPro 9.1.Les corbes de recuperació es van ajustar a un model mono-exponencial per tenir en compte la difusió molecular amb un terme exponencial addicional per tenir en compte l'efecte de blanqueig de l'adquisició.A continuació, vam calcular D utilitzant el radi de blanqueig nominal i la vida mitjana de recuperació prèviament determinada com a l'equació de Kang et al.5 35 mostrat.
Les variants simples de cisteïna d'αS es van sintetitzar amb 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-oxyl (TEMPOL) a les posicions 24 (TEMPOL-24-αS) i 122 (TEMPOL-122-αS), respectivament.Etiquetatge de gir Per als experiments EPR, la concentració d'αS es va establir en 100 μM i la concentració de PEG era del 15% (p/v).Per a diverses condicions d'agregació, la relació αS:pLK era 1:10, mentre que les relacions αS:ΔNt-Tau i αS:Tau441 es van mantenir a 1:1.Per als experiments de valoració d'unió en absència d'amuntegament, TEMPOL-122-αS es va mantenir a 50 μM i els polications es van valorar a concentracions creixents, preparant cada condició per separat.Les mesures CW-EPR es van realitzar mitjançant un espectròmetre de banda X Bruker ELEXSYS E580 equipat amb un ressonador Bruker ER4118 SPT-N1 que funcionava a una freqüència de microones (SHF) de ~ 9,7 GHz.La temperatura es va establir a 25 ° C i es va controlar amb un criostat de nitrogen líquid.Els espectres es van obtenir en condicions insaturades a una potència MW de 4 mW, una amplitud de modulació de 0, 1 mT i una freqüència de modulació de 100 kHz.Les intensitats espectrals es van normalitzar per evitar diferències en les concentracions de spin entre mostres i una possible reducció de spin a causa de concentracions residuals d'agents reductors en mostres que contenien Tau441 o ΔNt-Tau (present a les solucions de proteïnes originals).Els valors donats de g es van obtenir com a resultat del modelatge espectral EPR realitzat mitjançant el programari Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) implementat a Matlab®67.Es van utilitzar models isòtrops d'un o dos components per modelar les dades.Després de normalitzar tots els senyals, es van calcular els residus restant cada simulació de l'espectre experimental corresponent.Per a l'anàlisi de valoració d'unió, es va utilitzar la intensitat relativa de la tercera banda a la segona banda de l'espectre EPR normalitzat (IIII/III) per controlar la unió dels polications a αS.Per estimar la constant de dissociació (Kd), la corba resultant es va ajustar a un model aproximat assumint n llocs d'unió idèntics i independents.
Els experiments d'espectroscòpia RMN es van dur a terme mitjançant un espectròmetre RMN Bruker Neo 800 MHz (1H) equipat amb una criosonda i un gradient Z.Tots els experiments es van realitzar amb 130–207 µM αS i els corresponents equivalents αS/ΔNt-Tau i pLK en HEPES 10 mM, NaCl 100 mM, DO al 10%, pH 7, 4 i es van realitzar a 15 ° C.Per controlar LPS per RMN, es va afegir un 10% de PEG a les mostres premesclades.El gràfic de pertorbació del canvi químic (Fig. 1b) mostra els canvis químics mitjans d'1H i 15N.Els espectres αS 2D1H-15N HSQC es van assignar en funció d'una assignació anterior (entrada BMRB #25227) i es van confirmar registrant i analitzant els espectres 3D de HNCA, HNCO i CBCAcoNH.Els desplaçaments químics 13Cα i 13Cβ es van calcular en presència de ΔNt-Tau o pLK per mesurar possibles canvis en les tendències de l'estructura secundària en comparació amb els canvis químics αS en la conformació de bobina aleatòria pura 68 (figura suplementària 5c).Les taxes R1ρ es van mesurar enregistrant experiments hsqctretf3gpsi (obtinguts de la biblioteca Bruker) amb retards de 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 i 800 ms, i les funcions exponencials es van ajustar als retards d'intensitat màxima diferents. vegades per determinar el R1ρ i la seva incertesa experimental.
Es van realitzar experiments de microscòpia de fluorescència resolta en temps de dos colors en un microscopi confocal de fluorescència MT200 amb resolució temporal comercial (PicoQuant, Berlín, Alemanya) amb un dispositiu de recompte de fotons únics correlacionat amb el temps (TCSPC).El capçal de díode làser s'utilitza per a l'excitació intercalada polsada (PIE), el feix passa a través d'una guia d'ona de mode únic i s'ajusta a una potència làser de 10 a 100 nW per a línies làser de 481 nm i 637 nm mesurades després d'un mirall dicroic.Això garanteix una velocitat de recompte de fotons òptima, evitant els efectes de l'àlies de fotons, el blanqueig fotogràfic i la saturació.Les plaques o cobertors d'angiogènesi μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemanya) es van col·locar directament en aigua d'immersió sobre una lent Super Apochromat 60x NA 1.2 amb un collaret correctiu (Olympus Life Sciences, Waltham, EUA).Es va utilitzar un mirall dicroic de 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, EUA) com a divisor del feix principal.La radiació no enfocada està bloquejada per un forat amb un diàmetre de 50 micres, després la radiació enfocada es divideix en 2 vies de detecció mitjançant un divisor de feix 50/50.Es van utilitzar filtres d'emissió de banda (Semrock, Lake Forest, IL, EUA) 520/35 per a colorant verd (AF488) i 690/70 per a colorant vermell (Atto647N) davant del detector.Com a detectors es van utilitzar díodes d'allau d'un sol fotó (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Itàlia).Tant la recollida de dades com l'anàlisi es van realitzar mitjançant el programari SymphoTime64 disponible comercialment (PicoQuant GmbH, Berlín, Alemanya).
Es van aplicar cinquanta microlitres de mostres de LLPS als pous d'angiogènesi μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemanya).Les imatges resultants se centren a 20 µm per sobre del fons del pou per obtenir una distància de treball objectiu òptima per a les gotes en suspensió i a ~ 1 µm per a les basses i els punts amb una resolució axial d'almenys 0,25 µm/píxel i un temps de retard de 400 µs/píxel.Seleccioneu les dades aplicant un llindar d'intensitat basat en la intensitat mitjana del senyal de fons (PBG, mitjana + 2σ) per a cada canal, de manera que només es seleccionen gotes, basses o taques de proteïnes líquides, filtrant qualsevol possible origen de la fase dispersa.Per analitzar la vida útil de cada espècie (τ) de cada canal (verd, "g" per a AF488 i vermell, "r" per a Atto647N), vam seleccionar regions d'interès (ROI) que contenien gotes, basses o taques (figura suplementària 1). ).8b) i els va derivar ajustant la seva decadència al llarg de la seva vida útil (τD, τR i τP per a gotes, basses o taques, respectivament, vegeu la figura suplementària 8c) a cada canal mitjançant una anàlisi de l'ajust de la cua i un model de desintegració de dos components.Mitjana τ a partir de τ .Els ROI que produïen massa pocs fotons per a un ajustament multiexponencial es van excloure de l'anàlisi.El tall utilitzat va ser <104 fotons per a les basses i els punts i 103 per a les gotes.Les gotes tenen un llindar més baix perquè és difícil obtenir corbes de decadència amb valors d'intensitat més alts, ja que les gotes en el camp d'imatge solen ser més petites i menys nombroses.Els ROI amb recomptes de fotons per sobre del límit d'acumulació de fotons (establert a > 500 recomptes/píxel) també es van descartar per a l'anàlisi.Relacioneu la corba de decadència d'intensitat obtinguda de la regió d'interès amb una intensitat al 90% del màxim (lleugerament després de la intensitat màxima de la decadència) des del començament de la vida útil per garantir una interferència mínima d'IRF mantenint la mateixa per a tota la caiguda d'intensitat. Configuració Finestra de temps relatiu Es van analitzar de 25 a 50 ROI per basses i taques i 15-25 ROI per gotes, imatges seleccionades entre més de 4 rèpliques registrades d'almenys 3 experiments independents.S'han utilitzat proves t de dues cues per avaluar diferències estadístiques entre espècies o entre sistemes de coacervats.Per a una anàlisi píxel per píxel de la vida útil (τ), es va calcular l'atenuació total de la vida útil sobre el camp per a cada canal i es va realitzar una aproximació d'un model d'atenuació exponencial de 2/3 components.A continuació, es va ajustar l'atenuació de la vida útil de cada píxel mitjançant valors τ calculats prèviament, donant lloc a una imatge d'ajust FLIM de pseudocolor.L'interval de vida útil de l'ajust de la cua era el mateix en totes les imatges del mateix canal, i cada decadència produïa prou fotons per proporcionar un ajust fiable.Per a l'anàlisi FRET, els píxels es van seleccionar aplicant un llindar d'intensitat inferior de 100 fotons, que va fer una mitjana d'un senyal de fons (FBG) d'11 fotons.La intensitat de fluorescència de cada canal es va corregir mitjançant factors de correcció determinats experimentalment: 69 diafonia espectral α va ser de 0,004, l'excitació directa β va ser de 0,0305, l'eficiència de detecció γ va ser de 0,517.A continuació, es calcula l'eficiència FRET a nivell de píxel mitjançant l'equació següent:
on FDD és la intensitat de fluorescència observada al canal donant (verd), FDA és la intensitat de fluorescència observada al canal acceptor (vermell) sota excitació indirecta i FAA és la intensitat de fluorescència observada al canal acceptor (vermell) sota excitació directa ( PASTIS).S'observen polsos d'intensitat de fluorescència al canal).
Col·loqueu 100 µl de solucions de reacció LLPS que contenen Tau441 monomèric no marcat de 25 µM (amb o sense 25 µM αS) en un tampó LLPS (complementat com a anterior) en microplaques de 96 pous no vinculants amb un recobriment de làmina adhesiva i es va comprovar la formació de gotes mitjançant microscòpia WF. equilibri.en 10 min.Després de 48 hores d'incubació a temperatura ambient, es va confirmar la presència de basses i taques de proteïnes.A continuació, traieu amb cura el líquid sobre les basses dels pous, després afegiu 50 L de tampó de dissociació (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 1 M, DTT 1 mM) i incubeu durant 10 min.L'alta concentració de sal garanteix que LLPS no es repeteixi a causa del PEG residual i es desmuntaran possibles conjunts de proteïnes formats només per interaccions electrostàtiques.A continuació, es va raspar amb cura el fons del pou amb una punta de micropipeta i la solució resultant es va transferir a un pou d'observació buit.Després de la incubació de les mostres amb 50 μM ThT durant 1 h, es va comprovar la presència de taques aïllades mitjançant microscòpia WF.Prepareu fibril·les αS sonicades incubant 300 µl d'una solució αS de 70 µM en PBS amb pH 7,4, azida de sodi 0,01% a 37 °C i 200 rpm en un agitador orbital durant 7 dies.A continuació, la solució es va centrifugar a 9600 × g durant 30 min, el pellet es va tornar a suspendre en PBS pH 7, 4 i es va sonicar (1 min, cicle del 50%, amplitud del 80% en un sonicador Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, EUA) mostres de fibril·les. amb una distribució de mida relativament uniforme de les fibril·les petites.
L'anàlisi FCS/FCCS i la detecció de coincidències de dos colors (TCCD) es van realitzar al mateix microscopi confocal fluorescent resolt en temps MT200 (Pico-Quant, Berlín, Alemanya) utilitzat per als experiments de microscòpia FLIM-FRET utilitzant el mode PIE.La potència del làser per a aquests experiments es va afegir a 6,0 µW (481 nm) i 6,2 µW (637 nm).La combinació d'aquestes potències làser es va triar per produir una brillantor similar per als parells de fluoròfors utilitzats alhora que s'aconseguia taxes de recompte òptimes i s'evita el fotoblanqueig i la saturació.Tant la recollida de dades com l'anàlisi es van realitzar mitjançant el programari SymphoTime64 versió 2.3 disponible comercialment (PicoQuant, Berlín, Alemanya).
Les mostres d'agregats αS/Tau aïllats obtinguts mitjançant LLPS es dilueixen en tampó d'aïllament a la concentració monomolecular adequada (normalment una dilució 1:500, ja que els agregats ja es troben en concentracions baixes quan s'aïllen de mostres de coacervat).Les mostres es van aplicar directament a cobertors (Corning, EUA) recoberts prèviament amb una solució de BSA a una concentració d'1 mg/mL.
Per a l'anàlisi PIE-smFRET als canals verd i vermell, es va aplicar un llindar d'intensitat inferior de 25 fotons per filtrar els senyals de baixa intensitat causats per esdeveniments monomèrics (tingueu en compte que els monòmers superen les mostres agregades en comparació amb els agregats aïllats).Aquest llindar es va calcular com a cinc vegades la intensitat mitjana d'αS monomèrica obtinguda a partir de l'anàlisi de mostres de monòmers purs per tal de seleccionar específicament agregats per a l'anàlisi.El circuit d'accionament PIE, juntament amb l'adquisició de dades TSCPC, ha permès l'aplicació d'un filtre de ponderació de tota la vida que ajuda a eliminar la diafonia de fons i espectral.La intensitat de flare seleccionada mitjançant els llindars anteriors es va corregir mitjançant el senyal de fons mitjà determinat a partir dels histogrames d'ocurrència versus la intensitat / safata de les mostres només de buffer.Les ràfegues associades a agregats grans normalment ocupen diversos contenidors consecutius en la traça temporal (establert a 1 ms).En aquests casos, es va optar per un contenidor de màxima resistència.Per a l'anàlisi FRET i estequiomètrica, es va utilitzar el factor gamma γ determinat teòricament (0, 517).La diafonia espectral i les contribucions d'excitació directa són insignificants (determinades experimentalment) a la potència del làser d'excitació utilitzada.L'eficiència i l'estequiometria de FRET en una explosió es calcula de la següent manera.