Gràcies per visitar Nature.com.Esteu utilitzant una versió del navegador amb suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).A més, per garantir un suport permanent, mostrem el lloc sense estils ni JavaScript.
Controls lliscants que mostren tres articles per diapositiva.Utilitzeu els botons enrere i següent per moure's per les diapositives, o els botons del controlador de diapositives al final per moure's per cada diapositiva.

Proveïdors de tubs de bobina d'acer inoxidable 317

Taula de composició química del material d'acer inoxidable

SPACA6 és una proteïna superficial expressada per l'esperma que és fonamental per a la fusió de gàmetes durant la reproducció sexual dels mamífers.Malgrat aquest paper fonamental, la funció específica de SPANA6 és poc entesa.Dilucidem l'estructura cristal·lina del domini extracel·lular de SPACA6 amb una resolució de 2, 2 Å, revelant una proteïna de dos dominis composta per un paquet de quatre cadenes i entrepans β semblants a Ig units per enllaços quasi flexibles.Aquesta estructura s'assembla a IZUMO1, una altra proteïna associada a la fusió de gàmetes, la qual cosa fa que SPACA6 i IZUMO1 siguin membres fundadors de la superfamília de proteïnes associades a la fecundació anomenada aquí superfamília IST.La superfamília IST es defineix estructuralment pel seu paquet de quatre hèlixs retorçats i un parell de motius CXXC enllaçats amb disulfur.Una cerca AlphaFold basada en l'estructura del proteoma humà va identificar membres proteics addicionals d'aquesta superfamília;notablement, moltes d'aquestes proteïnes estan implicades en la fusió de gàmetes.L'estructura SPACA6 i la seva relació amb altres membres de la superfamília IST proporcionen l'enllaç que falta en el nostre coneixement de la fusió de gàmetes de mamífers.
Tota vida humana comença amb dos gàmetes haploides separats: l'esperma del pare i l'òvul de la mare.Aquest espermatozoide és el guanyador d'un intens procés de selecció durant el qual milions d'espermatozoides travessen el tracte genital femení, superen diversos obstacles1 i se sotmeten a una capacitació, que millora la seva motilitat i el procés dels components superficials2,3,4.Fins i tot si l'esperma i l'oòcit es troben, el procés encara no ha acabat.L'oòcit està envoltat per una capa de cèl·lules cúmulus i una barrera de glicoproteïnes anomenada zona pel·lúcida, per on han de passar els espermatozoides per entrar a l'oòcit.Els espermatozoides utilitzen una combinació de molècules d'adhesió superficial i enzims secretats i associats a la membrana per superar aquestes barreres finals5.Aquestes molècules i enzims s'emmagatzemen principalment a la membrana interna i la matriu acrosòmica i es detecten quan la membrana externa de l'esperma es lisa durant la reacció acrosòmica6.El darrer pas d'aquest intens viatge és l'esdeveniment de fusió esperma-òvul, en què les dues cèl·lules fusionen les seves membranes per convertir-se en un únic organisme diploide7.Tot i que aquest procés és innovador en la reproducció humana, les interaccions moleculars necessàries són poc enteses.
A més de la fecundació de gàmetes, s'ha estudiat àmpliament la química de la fusió de dues bicapas lipídiques.En general, la fusió de membranes és un procés energèticament desfavorable que requereix que un catalitzador proteic experimenti un canvi de conformació estructural que apropi dues membranes, trencant la seva continuïtat i provocant la fusió8,9.Aquests catalitzadors de proteïnes es coneixen com a fusògens i s'han trobat en innombrables sistemes de fusió.Són necessaris per a l'entrada viral a les cèl·lules hostes (p. ex., gp160 en VIH-1, pic en coronavirus, hemaglutinina en virus de la grip)10,11,12 fusions placentàries (sincitina)13,14,15 i gàmetes en eucariotes inferiors ( HAP2/GCS1 en plantes, protistes i artròpodes) 16,17,18,19.Els fusògens per als gàmetes humans encara no s'han descobert, tot i que s'ha demostrat que diverses proteïnes són crítiques per a la unió i la fusió dels gàmetes.El CD9 expressat per oòcits, una proteïna transmembrana necessària per a la fusió de gàmetes de ratolí i humans, va ser el primer que es va descobrir 21,22,23.Tot i que la seva funció precisa no està clara, sembla probable que hi hagi un paper en l'adhesió, l'estructura dels focus d'adhesió a les microvellositats de l'ou i/o la localització correcta de les proteïnes de la superfície dels oòcits 24,25,26.Les dues proteïnes més típiques que són crítiques per a la fusió de gàmetes són la proteïna espermàtica IZUMO127 i la proteïna oòcit JUNO28, i la seva associació mútua és un pas important en el reconeixement i l'adhesió dels gàmetes abans de la fusió.Els ratolins knockout Izumo1 mascles i els ratolins knockout Juno femenins són completament estèrils, en aquests models els espermatozoides entren a l'espai perivitel·lí però els gàmetes no es fusionen.De la mateixa manera, la confluència es va reduir quan es van tractar els gàmetes amb anticossos anti-IZUMO1 o JUNO27,29 en experiments de fecundació in vitro humana.
Recentment, s'ha descobert un grup recentment de proteïnes expressades per espermatozoides fenotípicament similars a IZUMO1 i JUNO20,30,31,32,33,34,35.La proteïna 6 associada a la membrana acrosomal de l'esperma (SPACA6) s'ha identificat com a essencial per a la fecundació en un estudi de mutagènesi murina a gran escala.La inserció del transgen en el gen Spaca6 produeix espermatozoides no fusibles, tot i que aquests espermatozoides s'infiltren a l'espai perivitel 36 .Estudis d'eliminació posteriors en ratolins van confirmar que Spaca6 és necessari per a la fusió de gàmetes 30,32.SPACA6 s'expressa gairebé exclusivament als testicles i té un patró de localització similar al d'IZUMO1, és a dir, dins de l'íntima dels espermatozoides abans de la reacció acrosomal, i després migra a la regió equatorial després de la reacció acrosomal 30,32.Els homòlegs de Spaca6 existeixen en una varietat de mamífers i altres eucariotes 30 i la seva importància per a la fusió de gàmetes humans s'ha demostrat mitjançant la inhibició de la fecundació humana in vitro per resistència a SPACA6 30 .A diferència d'IZUMO1 i JUNO, els detalls de l'estructura, les interaccions i la funció de SPACA6 encara no estan clars.
Per entendre millor el procés fonamental subjacent a la fusió d'espermatozoides i òvuls humans, que ens permetrà informar sobre futurs desenvolupaments en planificació familiar i tractament de fertilitat, hem dut a terme estudis estructurals i bioquímics PACA6.L'estructura cristal·lina del domini extracel·lular de SPACA6 mostra un paquet de quatre helicoïdals (4HB) i un domini semblant a la immunoglobulina (Ig-like) connectats per regions quasi flexibles.Tal com es va predir en estudis anteriors,7,32,37 l'estructura del domini de SPACA6 és similar a la de l'IZUMO1 humà, i les dues proteïnes comparteixen un motiu inusual: 4HB amb una superfície helicoïdal triangular i un parell de motius CXXC lligats a disulfur.Proposem que IZUMO1 i SPACA6 defineixin ara una superfamília més gran i estructuralment relacionada de proteïnes associades a la fusió de gàmetes.Utilitzant característiques úniques de la superfamília, vam realitzar una cerca exhaustiva del proteoma humà estructural AlphaFold, identificant membres addicionals d'aquesta superfamília, inclosos diversos membres implicats en la fusió i/o la fecundació de gàmetes.Ara sembla que hi ha un plec estructural comú i una superfamília de proteïnes associades a la fusió de gàmetes, i la nostra estructura proporciona un mapa molecular d'aquest aspecte important del mecanisme de fusió de gàmetes humans.
SPACA6 és una proteïna transmembrana d'un sol pas amb un glicà lligat a N i sis enllaços disulfur putatius (figures S1a i S2).Vam expressar el domini extracel·lular de SPACA6 humà (residus 27-246) a les cèl·lules de Drosophila S2 i vam purificar la proteïna mitjançant cromatografia d'afinitat per al níquel, intercanvi de cations i exclusió de mida (Fig. S1b).L'ectodomini SPACA6 purificat és molt estable i homogeni.L'anàlisi mitjançant cromatografia d'exclusió de mida combinada amb dispersió de llum poligonal (SEC-MALS) va revelar un pic amb un pes molecular calculat de 26, 2 ± 0, 5 kDa (Fig. S1c).Això és coherent amb la mida de l'ectodomini monomèric SPACA6, cosa que indica que l'oligomerització no es va produir durant la purificació.A més, l'espectroscòpia de dicroisme circular (CD) va revelar una estructura α / β mixta amb un punt de fusió de 51, 3 ° C (Fig. S1d, e).La desconvolució dels espectres CD va revelar un 38, 6% d'elements helicoïdals α i un 15, 8% d'elements de cadena β (figura S1d).
L'ectodomini SPACA6 es va cristal·litzar mitjançant sembra de matriu aleatòria38 donant lloc a un conjunt de dades amb una resolució de 2, 2 Å (taula 1 i figura S3).Utilitzant una combinació de substitució molecular basada en fragments i dades de fase SAD amb exposició al bromur per a la determinació de l'estructura (taula 1 i figura S4), el model refinat final consta dels residus 27-246.En el moment en què es va determinar l'estructura, no hi havia disponibles estructures experimentals o AlphaFold.L'ectodomini SPACA6 mesura 20 Å × 20 Å × 85 Å, consta de set hèlixs i nou cadenes β i té un plec terciari allargat estabilitzat per sis enllaços disulfur (Fig. 1a, b).La feble densitat d'electrons al final de la cadena lateral Asn243 indica que aquest residu és una glicosilació lligada a N.L'estructura consta de dos dominis: un feix de quatre hèlixs N-terminal (4HB) i un domini semblant a Ig C-terminal amb una regió frontissa intermèdia entre ells (Fig. 1c).
a Estructura del domini extracel·lular de SPACA6.Diagrama de franges del domini extracel·lular de SPACA6, el color de la cadena de N a C-terminal del blau fosc al vermell fosc.Les cisteïnes implicades en els enllaços disulfur es destaquen en magenta.b Topologia del domini extracel·lular de SPACA6.Utilitzeu el mateix esquema de colors que a la figura 1a.c Domini extracel·lular SPANA6.Els gràfics de franges de domini 4HB, frontissa i Ig són de color taronja, verd i blau, respectivament.Les capes no estan dibuixades a escala.
El domini 4HB de SPACA6 inclou quatre hèlixs principals (hèlix 1-4), que es disposen en forma d'hèlix helicoïdal (Fig. 2a), alternant entre interaccions antiparal·leles i paral·leles (Fig. 2b).Una petita hèlix addicional d'un sol gir (hèlix 1′) es col·loca perpendicularment al feix, formant un triangle amb les hèlixs 1 i 2. Aquest triangle està lleugerament deformat a l'embalatge helicoïdal retorçat de l'embalatge relativament dens de les hèlixs 3 i 4 ( Fig. 2a).
Gràfic de regletes de terminals N 4HB.b Vista superior d'un paquet de quatre hèlixs, cada hèlix destacada en blau fosc a l'extrem N i vermell fosc a l'extrem C.c Diagrama de roda espiral de dalt a baix per a 4HB, amb cada residu mostrat com un cercle etiquetat amb un codi d'aminoàcid d'una sola lletra;només els quatre aminoàcids de la part superior de la roda estan numerats.Els residus no polars són de color groc, els residus polars sense càrrega tenen color verd, els residus carregats positivament són de color blau i els residus carregats negativament són de color vermell.d Cares triangulars del domini 4HB, amb 4HBs en taronja i frontisses en verd.Les dues insercions mostren enllaços disulfur en forma de vareta.
4HB es concentra en un nucli hidrofòbic intern compost principalment per residus alifàtics i aromàtics (Fig. 2c).El nucli conté un enllaç disulfur entre Cys41 i Cys55 que uneix les hèlixs 1 i 2 en un triangle elevat superior (figura 2d).Es van formar dos enllaços disulfur addicionals entre el motiu CXXC a l'hèlix 1 'i un altre motiu CXXC trobat a la punta de la forquilla β a la regió de la frontissa (figura 2d).Un residu d'arginina conservador amb una funció desconeguda (Arg37) es troba dins d'un triangle buit format per hèlixs 1′, 1 i 2. Els àtoms de carboni alifàtics Cβ, Cγ i Cδ Arg37 interaccionen amb el nucli hidrofòbic, i els seus grups guanidina es mouen cíclicament. entre les hèlixs 1′ i 1 mitjançant interaccions entre la columna vertebral Thr32 i la cadena lateral (Fig. S5a, b).Tyr34 s'estén a la cavitat deixant dues petites cavitats a través de les quals Arg37 pot interactuar amb el dissolvent.
Els dominis β-sandwich semblants a Ig són una gran superfamília de proteïnes que comparteixen la característica comuna de dues o més làmines β amfipàtiques multicadenes que interactuen mitjançant un nucli hidrofòbic 39. El domini semblant a Ig C-terminal de SPACA6 té el mateix patró. i consta de dues capes (Fig. S6a).El full 1 és un full β de quatre cadenes (cadenes D, F, H i I) on les cadenes F, H i I formen una disposició antiparal·lela i les cadenes I i D tenen una interacció paral·lela.La taula 2 és un petit full antiparal·lel de doble cadena beta (cadenes E i G).Es va observar un enllaç disulfur intern entre l'extrem C-terminal de la cadena E i el centre de la cadena H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Aquest enllaç disulfur és anàleg a l'enllaç disulfur del domini β-entrepà de la immunoglobulina40,41.
El full β de quatre cadenes es retorça al llarg de tota la seva longitud, formant vores asimètriques que difereixen en forma i electrostàtica.La vora més prima és una superfície ambiental plana hidròfoba que destaca en comparació amb les superfícies desiguals i electrostàticament diverses restants a PACA6 (Fig. S6b, c).Un halo de grups carbonil/amino de la columna vertebral exposada i cadenes laterals polars envolta la superfície hidrofòbica (Fig. S6c).El marge més ample està cobert per un segment helicoïdal cobert que bloqueja la porció N-terminal del nucli hidrofòbic i forma tres enllaços d'hidrogen amb el grup polar obert de l'esquelet de la cadena F (Fig. S6d).La part C-terminal d'aquesta vora forma una gran butxaca amb un nucli hidrofòbic parcialment exposat.La butxaca està envoltada de càrregues positives a causa de tres conjunts de residus dobles d'arginina (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 i Arg212-Arg214) i una histidina central (His220) (Figura S6e).
La regió frontissa és un segment curt entre el domini helicoïdal i el domini semblant a Ig, format per una capa β antiparal·lela de tres cadenes (cadenes A, B i C), una petita hèlix de 310 i diversos segments helicoïdals aleatoris llargs.(Fig. S7).Una xarxa de contactes covalents i electrostàtics a la regió de la frontissa sembla estabilitzar l'orientació entre 4HB i el domini semblant a Ig.La xarxa es pot dividir en tres parts.La primera part inclou dos motius CXXC (27CXXC30 i 139CXXC142) que formen un parell d'enllaços disulfur entre la forquilla β de la frontissa i l'hèlix 1′ a 4HB.La segona part inclou interaccions electrostàtiques entre el domini semblant a Ig i la frontissa.Glu132 a la frontissa forma un pont de sal amb Arg233 al domini semblant a Ig i Arg135 a la frontissa.La tercera part inclou un enllaç covalent entre el domini semblant a Ig i la regió frontissa.Dos enllaços disulfur (Cys124-Cys147 i Cys128-Cys153) connecten el bucle de la frontissa a un enllaç que s'estabilitza mitjançant interaccions electrostàtiques entre Gln131 i el grup funcional de la columna vertebral, permetent l'accés al primer domini semblant a Ig.cadena.
L'estructura de l'ectodomini SPANA6 i les estructures individuals de 4HB i dominis semblants a Ig es van utilitzar per cercar registres estructuralment similars a les bases de dades de proteïnes 42 .Hem identificat coincidències amb puntuacions altes de Dali Z, petites desviacions estàndard i puntuacions LALI grans (aquest últim és el nombre de residus estructuralment equivalents).Tot i que les primeres 10 visites de la cerca completa d'ectodomini (taula S1) tenien una puntuació Z acceptable de> 842, només una cerca de dominis semblants a 4HB o Ig va mostrar que la majoria d'aquestes visites corresponien només a entrepans β.un plec omnipresent que es troba en moltes proteïnes.Les tres cerques a Dali només van donar un resultat: IZUMO1.
Fa temps que s'ha suggerit que SPACA6 i IZUMO1 comparteixen similituds estructurals7,32,37.Tot i que els ectodominis d'aquestes dues proteïnes associades a la fusió de gàmetes només comparteixen un 21% d'identitat de seqüència (figura S8a), l'evidència complexa, que inclou un patró d'enllaç disulfur conservat i un domini semblant a Ig C-terminal previst a SPACA6, va permetre els primers intents de construir un model d'homologia d'A un ratolí SPACA6 utilitzant IZUMO1 com a plantilla37.La nostra estructura confirma aquestes prediccions i mostra el veritable grau de similitud.De fet, les estructures SPACA6 i IZUMO137,43,44 comparteixen la mateixa arquitectura de dos dominis (Fig. S8b) amb dominis similars 4HB i β-sandwich similars a Ig connectats per una regió frontissa (Fig. S8c).
IZUMO1 i SPANA6 4HB tenen diferències comunes amb els paquets espirals convencionals.Els 4HB típics, com els que es troben en els complexos proteics SNARE implicats en la fusió endosòmica 45,46, tenen hèlixs uniformement espaiats mantenint una curvatura constant al voltant d'un eix central 47. En canvi, els dominis helicoïdals tant a IZUMO1 com a SPACA6 estaven distorsionats, amb curvatura variable i embalatge desigual (figura S8d).El gir, probablement causat pel triangle format per les hèlixs 1′, 1 i 2, es manté a IZUMO1 i SPACA6 i s'estabilitza pel mateix motiu CXXC a l'hèlix 1′.Tanmateix, l'enllaç disulfur addicional que es troba a SPACA6 (Cys41 i Cys55 que uneixen de manera covalent les hèlixs 1 i 2 anteriors) crea un àpex més afilat a l'àpex del triangle, fent que SPACA6 sigui més retorçat que IZUMO1, amb triangles de cavitat més pronunciats.A més, IZUMO1 manca d'Arg37 observat al centre d'aquesta cavitat a SPACA6.En canvi, IZUMO1 té un nucli hidrofòbic més típic de residus alifàtics i aromàtics.
IZUMO1 té un domini semblant a Ig que consisteix en un full β de doble cadena i cinc cadenes43.La cadena addicional a IZUMO1 substitueix la bobina a SPACA6, que interacciona amb la cadena F per limitar els enllaços d'hidrogen de la columna vertebral a la cadena.Un punt de comparació interessant és la càrrega superficial prevista dels dominis semblants a Ig de les dues proteïnes.La superfície IZUMO1 està més carregada negativament que la superfície SPACA6.Una càrrega addicional es troba a prop de l'extrem C-terminal que mira a la membrana espermàtica.A SPACA6, les mateixes regions eren més neutres o carregades positivament (Fig. S8e).Per exemple, la superfície hidròfoba (vores més primes) i les fosses carregades positivament (vores més amples) a SPACA6 estan carregades negativament a IZUMO1.
Tot i que la relació i els elements d'estructura secundària entre IZUMO1 i SPACA6 estan ben conservats, l'alineació estructural dels dominis semblants a Ig va mostrar que els dos dominis difereixen en la seva orientació general entre si (Fig. S9).El paquet espiral d'IZUMO1 es corba al voltant de l'entrepà β, creant la forma de "bumerang" descrita anteriorment a uns 50 ° de l'eix central.En canvi, el feix helicoïdal de l'SPACA6 es va inclinar uns 10 ° en la direcció oposada.Les diferències en aquestes orientacions es deuen probablement a diferències en la regió de la frontissa.A nivell de seqüència primària, IZUMO1 i SPACA6 comparteixen poca similitud de seqüències a la frontissa, a excepció dels residus de cisteïna, glicina i àcid aspártic.Com a resultat, els enllaços d'hidrogen i les xarxes electrostàtiques són completament diferents.IZUMO1 i SPACA6 comparteixen els elements d'estructura secundària de fulla β, tot i que les cadenes d'IZUMO1 són molt més llargues i l'hèlix 310 (hèlix 5) és exclusiva de SPACA6.Aquestes diferències donen lloc a diferents orientacions de domini per a dues proteïnes semblants.
La nostra cerca del servidor Dali va revelar que SPACA6 i IZUMO1 són les dues úniques estructures determinades experimentalment emmagatzemades a la base de dades de proteïnes que tenen aquest plec de 4HB en particular (taula S1).Més recentment, DeepMind (Alphabet/Google) ha desenvolupat AlphaFold, un sistema basat en xarxes neuronals que pot predir amb precisió les estructures 3D de proteïnes a partir de seqüències primàries48.Poc després de resoldre l'estructura PACA6, es va publicar la base de dades AlphaFold, que proporciona models d'estructura predictiva que cobreixen el 98,5% de totes les proteïnes del proteoma humà48,49.Utilitzant la nostra estructura SPACA6 resolta com a model de cerca, una cerca d'homologia estructural del model al proteoma humà AlphaFold va identificar candidats amb possibles similituds estructurals amb SPACA6 i IZUMO1.Donada la increïble precisió d'AlphaFold per predir SPACA6 (Fig. S10a), especialment l'ectodomini d'1,1 Å rms en comparació amb la nostra estructura resolta (Fig. S10b), podem estar segurs que les coincidències SPACA6 identificades probablement siguin precises.
Anteriorment, PSI-BLAST va cercar el clúster IZUMO1 amb altres tres proteïnes associades a l'esperma: IZUMO2, IZUMO3 i IZUMO450.AlphaFold va predir que aquestes proteïnes de la família IZUMO es pleguen al domini 4HB amb el mateix patró d'enllaç disulfur que IZUMO1 (figures 3a i S11), tot i que no tenen un domini semblant a Ig.Es planteja la hipòtesi que IZUMO2 i IZUMO3 són proteïnes de membrana unilaterals similars a IZUMO1, mentre que IZUMO4 sembla estar secretada.No s'han determinat les funcions de les proteïnes IZUMO 2, 3 i 4 en la fusió de gàmetes.Se sap que IZUMO3 té un paper en la biogènesi de l'acrosoma durant el desenvolupament dels espermatozoides51, i la proteïna IZUMO forma un complex50.La conservació de les proteïnes IZUMO en mamífers, rèptils i amfibis suggereix que la seva funció potencial és coherent amb la d'altres proteïnes conegudes associades a la fusió de gàmetes, com ara DCST1/2, SOF1 i FIMP.
Diagrama de l'arquitectura de dominis de la superfamília IST, amb dominis 4HB, frontissa i Ig ressaltats en taronja, verd i blau, respectivament.IZUMO4 té una regió C-terminal única que sembla negre.Els enllaços disulfur confirmats i putatius es mostren amb línies sòlides i de punts, respectivament.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) i AlphaFEM95 DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) es mostren en la mateixa gamma de colors que el panell A. Els enllaços disulfur es mostren en magenta.Les hèlixs transmembrana TMEM95, IZUMO2 i IZUMO3 no es mostren.
A diferència de la proteïna IZUMO, es creu que altres proteïnes SPACA (és a dir, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 i SPACA9) són estructuralment diferents de SPACA6 (Fig. S12).Només SPACA9 té 4HB, però no s'espera que tingui la mateixa orientació paral·lel-antiparal·lel o el mateix enllaç disulfur que SPACA6.Només SPACA1 té un domini semblant a Ig.AlphaFold prediu que SPACA3, SPACA4 i SPACA5 tenen una estructura completament diferent de l'SPACA6.Curiosament, també se sap que SPACA4 té un paper en la fecundació, però en major mesura que SPACA6, en lloc de facilitar la interacció entre l'esperma i la zona pel·lúcida de l'oòcit52.
La nostra cerca AlphaFold ha trobat una altra coincidència per a IZUMO1 i PACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, una proteïna transmembrana específica de l'espermatozoide, fa que els ratolins mascles siguin infèrtils quan s'ablació 32,33.Els espermatozoides que no tenien TMEM95 tenien una morfologia normal, motilitat i capacitat de penetrar a la zona pel·lúcida i unir-se a la membrana de l'ou, però no podien fusionar-se amb la membrana de l'oòcit.Estudis anteriors han demostrat que TMEM95 comparteix similituds estructurals amb IZUMO133.De fet, el model AlphaFold va confirmar que TMEM95 és un 4HB amb el mateix parell de motius CXXC que IZUMO1 i SPACA6 i el mateix enllaç disulfur addicional entre les hèlixs 1 i 2 que es troba a SPACA6 (Fig. 3a i S11).Tot i que TMEM95 no té un domini semblant a Ig, té una regió amb un patró d'enllaç disulfur similar a les regions frontissa SPACA6 i IZUMO1 (Fig. 3b).En el moment de la publicació d'aquest manuscrit, el servidor de preimpressió va informar de l'estructura de TMEM95, confirmant el resultat AlphaFold53.TMEM95 és molt semblant a SPACA6 i IZUMO1 i ja es conserva evolutivament en amfibis (Fig. 4 i S13).
La cerca PSI-BLAST va utilitzar les bases de dades NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP i SOF1 per determinar la posició d'aquestes seqüències a l'arbre de la vida.Les distàncies entre els punts de branca no es mostren a escala.
La sorprenent similitud estructural general entre SPACA6 i IZUMO1 suggereix que són membres fundadors d'una superfamília estructural conservada que inclou les proteïnes TMEM95 i IZUMO 2, 3 i 4.membres coneguts: IZUMO1, SPACA6 i TMEM95.Com que només uns pocs membres tenen dominis semblants a Ig, el segell distintiu de la superfamília IST és el domini 4HB, que té característiques úniques comunes a totes aquestes proteïnes: 1) 4HB enrotllat amb hèlixs disposades en una alternança antiparal·lel/paral·lel (Fig. . 5a), 2) el paquet té una cara triangular que consta de dues hèlixs dins del paquet i una tercera hèlix vertical (figura àrea clau (Fig. 5c). Se sap que el motiu CXXC, que es troba a les proteïnes semblants a la tioredoxina, funciona com a sensor redox 54,55,56, mentre que el motiu dels membres de la família IST es pot associar amb proteïnes disulfur isomerases com ERp57 en la fusió de gàmetes.
Els membres de la superfamília IST es defineixen per tres trets característics del domini 4HB: quatre hèlixs que s'alternen entre orientació paral·lela i antiparal·lela, cares de paquets helicoïdals ba-triangulars i un doble motiu ca CXXC format entre molècules petites.) Hèlixs N-terminals (taronja) i horquilla β de la regió frontissa (verd).
Donada la similitud entre SPACA6 i IZUMO1, es va provar la capacitat del primer d'unir-se a IZUMO1 o JUNO.La interferometria de biocapa (BLI) és un mètode d'unió basat en cinètica que s'ha utilitzat anteriorment per quantificar la interacció entre IZUMO1 i JUNO.Després de la incubació del sensor marcat amb biotina amb IZUMO1 com a esquer amb una alta concentració d'analit JUNO, es va detectar un senyal fort (Fig. S14a), que indica un canvi induït per la unió en el gruix del biomaterial connectat a la punta del sensor.Senyals similars (és a dir, JUNO acoblat al sensor com a esquer contra l'analit IZUMO1) (Fig. S14b).No es va detectar cap senyal quan es va utilitzar SPACA6 com a analit contra IZUMO1 lligat al sensor o JUNO lligat al sensor (figura S14a, b).L'absència d'aquest senyal indica que el domini extracel·lular de SPACA6 no interacciona amb el domini extracel·lular d'IZUMO1 o JUNO.
Com que l'assaig BLI es basa en la biotinilació de residus de lisina lliure a la proteïna de l'esquer, aquesta modificació pot evitar la unió si els residus de lisina estan implicats en la interacció.A més, l'orientació de la unió en relació amb el sensor pot crear obstacles estèrics, de manera que també es van realitzar assajos de desplegament convencionals als ectodominis recombinants SPACA6, IZUMO1 i JUNO.Malgrat això, SPACA6 no va precipitar amb IZUMO1 marcat amb His o JUNO etiquetat amb His (Fig. S14c, d), cosa que indica que no hi ha interacció coherent amb l'observada en experiments BLI.Com a control positiu, vam confirmar la interacció de JUNO amb l'etiqueta His IZUMO1 (figures S14e i S15).
Malgrat la similitud estructural entre SPACA6 i IZUMO1, la incapacitat de SPACA6 per unir JUNO no és sorprenent.La superfície de l'IZUMO1 humà té més de 20 residus que interaccionen amb JUNO, inclosos els residus de cadascuna de les tres regions (tot i que la majoria d'ells es troben a la regió de la frontissa) (Fig. S14f).D'aquests residus, només un es conserva a PACA6 (Glu70).Tot i que moltes substitucions de residus van conservar les seves propietats bioquímiques originals, el residu essencial Arg160 a IZUMO1 va ser substituït per l'Asp148 carregat negativament a SPACA6;estudis anteriors han demostrat que la mutació Arg160Glu a IZUMO1 suprimeix gairebé completament la unió a JUNO43.A més, la diferència d'orientació del domini entre IZUMO1 i SPACA6 va augmentar significativament la superfície del lloc d'unió a JUNO de la regió equivalent a SPACA6 (Fig. S14g).
Malgrat la necessitat coneguda de SPACA6 per a la fusió de gàmetes i la seva similitud amb IZUMO1, SPACA6 no sembla tenir una funció d'unió JUNO equivalent.Per tant, hem intentat combinar les nostres dades estructurals amb proves d'importància proporcionades per la biologia evolutiva.L'alineació de seqüències dels homòlegs de PACA6 mostra la conservació de l'estructura comuna més enllà dels mamífers.Per exemple, els residus de cisteïna estan presents fins i tot en amfibis llunyans (Fig. 6a).Mitjançant el servidor ConSurf, es van mapejar dades de retenció d'alineació de múltiples seqüències de 66 seqüències a la superfície SPACA6.Aquest tipus d'anàlisi pot mostrar quins residus s'han conservat durant l'evolució de les proteïnes i pot indicar quines regions superficials tenen un paper en la funció.
a Alineació de seqüències d'ectodominis PACA6 de 12 espècies diferents preparades amb CLUSTAL OMEGA.Segons l'anàlisi de ConSurf, les posicions més conservadores estan marcades en blau.Els residus de cisteïna es destaquen en vermell.Els límits del domini i els elements d'estructura secundària es mostren a la part superior de l'alineació, on les fletxes indiquen cadenes β i les ones indiquen hèlixs.Els identificadors d'accés de l'NCBI que contenen les seqüències són: humà (Homo sapiens, NP_001303901), mandril (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), mico caputxin (Cebus mimic, XP_017359366), cavall (Equus caballus), killer (Equus caballus, XP_02350, XP_02350, XP_02350) XP_032_034) .), ovella (Ovis aries, XP_014955560), elefant (Loxodonta africana, XP_010585293), gos (Canis lupus familyis, XP_025277208), ratolí (Mus musculus, NP_001156381), diable de Tasmània (Sar1, XP_03, XP_03), 8) , 61_89 i Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).La numeració es basa en l'ordre humà.b Representació superficial de l'estructura SPACA6 amb 4HB a la part superior i domini semblant a Ig a la part inferior, colors basats en estimacions de conservació del servidor ConSurf.Les parts millor conservades són de color blau, les parts moderadament conservades són de color blanc i les menys conservades són de groc.cisteïna morada.Tres pedaços de superfície que demostren un alt nivell de protecció es mostren als pegats etiquetats 1, 2 i 3. A la part superior dreta es mostra un dibuix animat 4HB (el mateix esquema de color).
L'estructura PACA6 té tres regions superficials molt conservades (Fig. 6b).El pegat 1 abasta 4HB i la regió de la frontissa i conté dos ponts disulfur CXXC conservats, una xarxa de frontissa Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fig. S7) i tres residus aromàtics exteriors conservats (Phe31, Tyr73, Phe137).una vora més ample del domini semblant a Ig (Fig. S6e), que representa diversos residus carregats positivament a la superfície de l'esperma.Curiosament, aquest pegat conté un epítop d'anticossos que s'ha demostrat anteriorment que interfereix amb la funció de PACA6 30.La regió 3 abasta la frontissa i un costat del domini semblant a Ig;aquesta regió conté prolines conservades (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) i residus polars/carregats cap a l'exterior.Sorprenentment, la majoria dels residus a la superfície de 4HB són molt variables (Fig. 6b), tot i que el plec es conserva a tot l'homòleg de SPACA6 (tal com indica el conservadorisme del nucli del paquet hidrofòbic) i més enllà de la superfamília IST.
Tot i que aquesta és la regió més petita de SPACA6 amb menys elements d'estructura secundària detectables, moltes restes de regió frontissa (inclosa la regió 3) estan molt conservades entre els homòlegs de SPACA6, cosa que pot indicar que l'orientació del paquet helicoïdal i l'entrepà β tenen un paper important.com a conservador.No obstant això, malgrat les extenses connexions d'hidrogen i les xarxes electrostàtiques a la regió de la frontissa de SPACA6 i IZUMO1, es poden veure proves de flexibilitat intrínseca en l'alineació de les múltiples estructures permeses d'IZUMO137,43,44.L'alineació dels dominis individuals es va solapar bé, però l'orientació dels dominis entre si va variar de 50 ° a 70 ° de l'eix central (Fig. S16).Per entendre la dinàmica conformacional de SPACA6 en solució, es van realitzar experiments SAXS (Fig. S17a, b).La reconstrucció ab initio de l'ectodomini SPACA6 s'ajustava a una estructura de cristall de vareta (Fig. S18), tot i que la trama de Kratky mostrava un cert grau de flexibilitat (Fig. S17b).Aquesta conformació contrasta amb IZUMO1, en què la proteïna no lligada assumeix una forma de bumerang tant a la gelosia com a la solució43.
Per identificar específicament la regió flexible, es va realitzar una espectroscòpia de masses d'intercanvi hidrogen-deuteri (H-DXMS) a SPACA6 i es va comparar amb les dades obtingudes prèviament a IZUMO143 (Fig. 7a, b).SPACA6 és clarament més flexible que IZUMO1, tal com indica un major intercanvi de deuteri a tota l'estructura després de 100.000 s d'intercanvi.En ambdues estructures, la part C-terminal de la regió frontissa mostra un alt nivell d'intercanvi, que probablement permet una rotació limitada dels dominis 4HB i semblants a Ig entre si.Curiosament, la part C-terminal de la frontissa SPACA6, que consisteix en el residu 147CDLPLDCP154, és una regió 3 altament conservada (Fig. 6b), cosa que possiblement indica que la flexibilitat entre dominis és una característica conservada evolutivament de SPACA6.Segons l'anàlisi de flexibilitat, les dades de fusió tèrmica de CD van mostrar que SPACA6 (Tm = 51,2 °C) és menys estable que IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (Fig. S1e i S19).
a Imatges H-DXMS de SPACA6 i b IZUMO1.El percentatge d'intercanvi de deuteri es va determinar en els punts de temps indicats.Els nivells d'intercanvi d'hidrogen-deuteri s'indiquen per color en una escala de gradient del blau (10%) al vermell (90%).Les caixes negres representen àrees d'alt intercanvi.Els límits de 4HB, frontissa i domini semblant a Ig observats a l'estructura cristal·lina es mostren a sobre de la seqüència primària.Els nivells d'intercanvi de deuteri als 10 s, 1000 s i 100.000 s es van representar en un gràfic de tires superposat a les superfícies moleculars transparents de SPACA6 i IZUMO1.Les parts de les estructures amb un nivell d'intercanvi de deuteri per sota del 50% són de color blanc.Les àrees per sobre del 50% d'intercanvi H-DXMS estan acolorides en una escala de gradient.
L'ús de CRISPR/Cas9 i estratègies genètiques d'eliminació del gen del ratolí ha portat a la identificació de diversos factors importants per a la unió i la fusió d'esperma i òvuls.A part de la interacció ben caracteritzada de l'estructura IZUMO1-JUNO i CD9, la majoria de les proteïnes associades a la fusió de gàmetes romanen estructuralment i funcionalment enigmàtiques.La caracterització biofísica i estructural de SPACA6 és una altra peça del trencaclosques molecular d'adhesió/fusió durant la fecundació.
SPACA6 i altres membres de la superfamília IST semblen estar molt conservats en mamífers, així com en ocells, rèptils i amfibis individuals;de fet, es creu que fins i tot es requereix SPACA6 per a la fecundació del peix zebra 59. Aquesta distribució és similar a altres proteïnes conegudes associades a la fusió de gàmetes com DCST134, DCST234, FIMP31 i SOF132, cosa que suggereix que aquests factors són deficients en HAP2 (també proteïnes conegudes com a GCS1) que són responsables de l'activitat catalítica de molts protistes., plantes i artròpodes.Proteïnes de fusió fecundades 60, 61. Malgrat la gran similitud estructural entre SPACA6 i IZUMO1, l'eliminació de gens que codifiquen qualsevol d'aquestes proteïnes va provocar infertilitat en ratolins mascles, cosa que indica que les seves funcions en la fusió de gàmetes no estan duplicades..De manera més àmplia, cap de les proteïnes espermàtiques conegudes necessàries per a la fase d'adhesió de la fusió és redundant.
Queda oberta la qüestió de si SPACA6 (i altres membres de la superfamília IST) participen en unions intergamètiques, formen xarxes intragamètiques per reclutar proteïnes importants als punts de fusió o potser fins i tot actuen com a fusògens esquius.Els estudis de co-immunoprecipitació en cèl·lules HEK293T van revelar una interacció entre IZUMO1 i SPACA632 de longitud completa.Tanmateix, els nostres ectodominis recombinants no van interactuar in vitro, cosa que suggereix que les interaccions observades a Noda et al.tots dos es van eliminar a la construcció (tingueu en compte la cua citoplasmàtica d'IZUMO1, que s'ha demostrat que no és necessària per a la fecundació62).Alternativament, IZUMO1 i/o SPACA6 poden requerir entorns d'unió específics que no reproduïm in vitro, com ara conformacions fisiològicament específiques o complexos moleculars que contenen altres proteïnes (conegudes o encara no descobertes).Tot i que es creu que l'ectodomini IZUMO1 media la fixació d'espermatozoides a l'òvul a l'espai perivitel·lí, el propòsit de l'ectodomini SPACA6 no està clar.
L'estructura de PACA6 revela diverses superfícies conservades que poden estar implicades en les interaccions proteïna-proteïna.La part conservada de la regió frontissa immediatament adjacent al motiu CXXC (designat com a Pegat 1 anterior) té diversos residus aromàtics orientats a l'exterior que sovint s'associen amb interaccions hidrofòbiques i d'apilament π entre biomolècules.Els costats amples del domini semblant a Ig (regió 2) formen un solc carregat positivament amb residus Arg i His molt conservats, i anteriorment s'han utilitzat anticossos contra aquesta regió per bloquejar la fusió de gàmetes 30 .L'anticòs reconeix l'epítop lineal 212RIRPAQLTHRGTFS225, que té tres dels sis residus d'arginina i His220 altament conservat.No està clar si la disfunció es deu al bloqueig d'aquests residus específics o a tota la regió.La ubicació d'aquest buit prop de l'extrem C-terminal de l'entrepà β indica interaccions cis amb proteïnes espermàtiques veïnes, però no amb proteïnes d'oòcits.A més, la retenció d'un embolic altament flexible ric en prolina (lloc 3) dins de la frontissa pot ser el lloc d'una interacció proteïna-proteïna o, més probablement, indicar la retenció de flexibilitat entre els dos dominis.El gènere és important per al paper desconegut de SPANA6.fusió de gàmetes.
SPACA6 té propietats de proteïnes d'adhesió intercel·lular, inclosos els entrepans β semblants a Ig.Moltes proteïnes adhesives (per exemple, cadherines, integrines, adhesines i IZUMO1) posseeixen un o més dominis β-sandwich que estenen les proteïnes des de la membrana cel·lular fins als seus objectius ambientals63,64,65.El domini semblant a Ig de SPACA6 també conté un motiu que es troba habitualment en entrepans β d'adhesió i cohesió: doblets de cadenes paral·leles als extrems dels entrepans β, coneguts com pinces mecàniques66.Es creu que aquest motiu augmenta la resistència a les forces de cisalla, la qual cosa és valuosa per a les proteïnes implicades en les interaccions intercel·lulars.No obstant això, malgrat aquesta similitud amb les adhesines, actualment no hi ha proves que SPACA6 interaccioni amb les clares d'ou.L'ectodomini SPACA6 no pot unir-se a JUNO i les cèl·lules HEK293T que expressen SPACA6, com es mostra aquí, gairebé no interaccionen amb els oòcits que no tenen zona 32.Si SPANA6 estableix enllaços intergamètics, aquestes interaccions poden requerir modificacions post-traduccions o estabilització per part d'altres proteïnes espermàtiques.En suport d'aquesta última hipòtesi, els espermatozoides amb deficiència d'IZUMO1 s'uneixen als oòcits, demostrant que molècules diferents d'IZUMO1 estan implicades en el pas d'adhesió dels gàmetes 27 .
Moltes proteïnes de fusió virals, cel·lulars i de desenvolupament tenen propietats que prediuen la seva funció com a fusògens.Per exemple, les glicoproteïnes de fusió viral (classes I, II i III) tenen un pèptid o bucle de fusió hidrofòbic a l'extrem de la proteïna que s'insereix a la membrana hoste.El mapa d'hidrofilicitat d'IZUMO143 i l'estructura (determinada i prevista) de la superfamília IST no mostraven un pèptid de fusió hidrofòbic aparent.Així, si alguna proteïna de la superfamília IST funciona com a fusògens, ho fa d'una manera diferent a la d'altres exemples coneguts.
En conclusió, les funcions dels membres de la superfamília de proteïnes IST associades a la fusió de gàmetes segueixen sent un misteri tentador.La nostra molècula recombinant SPACA6 caracteritzada i la seva estructura resolta proporcionaran informació sobre les relacions entre aquestes estructures compartides i el seu paper en la unió i la fusió de gàmetes.
La seqüència d'ADN corresponent a l'ectodomini SPACA6 humà previst (número d'adhesió NCBI NP_001303901.1; residus 27–246) es va optimitzar amb codons per a l'expressió a les cèl·lules S2 de Drosophila melanogaster i es va sintetitzar com a fragment gènic amb la seqüència que codifica Kozak (Eurofin)., el senyal de secreció BiP i els extrems 5' i 3' corresponents per a la clonació independent de la lligadura d'aquest gen en un vector d'expressió pMT basat en un promotor de metalotioneïna modificat per a la selecció amb puromicina (pMT-puro).El vector pMT-puro codifica un lloc de ruptura de trombina seguit d'una etiqueta C-terminal 10x-His (figura S2).
La transfecció estable del vector pMT-puro SPACA6 a cèl·lules de D. melanogaster S2 (Gibco) es va realitzar de manera similar al protocol utilitzat per IZUMO1 i JUNO43.Les cèl·lules S2 es van descongelar i es van cultivar en medi de Schneider (Gibco) complementat amb una concentració final del 10% (v/v) de sèrum fetal de vedella inactivat per calor (Gibco) i antibiòtic antimicòtic 1X (Gibco).Les cèl·lules de pas primerenc (3, 0 x 106 cèl·lules) es van xapar en pous individuals de plaques de 6 pous (Corning).Després de 24 hores d'incubació a 27 ° C, les cèl·lules es van transfectar amb una barreja de 2 mg del vector pMT-puro SPACA6 i reactiu de transfecció Effectene (Qiagen) segons el protocol del fabricant.Les cèl·lules transfectades es van incubar durant 72 hores i després es van recollir amb 6 mg/ml de puromicina.A continuació, es van aïllar les cèl·lules del medi de Schneider complet i es van col·locar en un medi Insect-XPRESS lliure de sèrum (Lonza) per a la producció de proteïnes a gran escala.Es va cultivar un lot d'1 L de cultiu de cèl·lules S2 fins a 8–10 × 106 ml-1 cèl·lules en un matràs Erlenmeyer de polipropilè de fons pla ventilat de 2 L i després es va esterilitzar amb una concentració final de 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) i es va filtrar estèril.induït.Els cultius induïts es van incubar a 27 °C a 120 rpm durant quatre dies.
El medi condicionat que contenia SPACA6 es va aïllar per centrifugació a 5660 × g a 4 ° C seguit d'un sistema de filtració de flux tangencial Centramate (Pall Corp) amb una membrana MWCO de 10 kDa.Apliqueu un medi concentrat que conté SPACA6 a una columna de 2 ml de resina d'agarosa Ni-NTA (Qiagen).La resina Ni-NTA es va rentar amb 10 volums de columna (CV) de tampó A i després es va afegir 1 CV de tampó A per donar una concentració final d'imidazol de 50 mM.SPACA6 es va eluir amb 10 ml de tampó A suplementat amb imidazol fins a una concentració final de 500 mM.La trombina de classe de restricció (Millipore Sigma) es va afegir directament al tub de diàlisi (MWCO 12-14 kDa) a 1 unitat per mg SPACA6 vs. 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 i 150 mM NaCl (tampó B) per a la diàlisi.) a 4 °C durant 48 hores.L'SPACA6 escindit per trombina es va diluir tres vegades per reduir la concentració de sal i es va carregar en una columna d'intercanvi catiònic MonoS 5/50 GL d'1 ml (Cytiva/GE) equilibrada amb Tris-HCl 10 mM, pH 7,5.L'intercanviador de cations es va rentar amb 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7, 5, després es va eluir SPACA6 amb un gradient lineal de 0 a 500 mm NaCl en 10 mm Tris-HCl, pH 7, 5 durant 25 OK.Després de la cromatografia d'intercanvi iònic, SPACA6 es va concentrar a 1 ml i es va eluir isocràticament des d'una columna ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) equilibrada amb el tampó B. Segons el cromatograma, les fraccions de l'agrupament i el concentrat que contenien SPACA6.La puresa es va controlar mitjançant electroforesi tenyida de Coomassie en un gel de poliacrilamida SDS al 16%.La concentració de proteïnes es va quantificar per absorbància a 280 nm mitjançant la llei de Beer-Lambert i el coeficient d'extinció molar teòric.
SPACA6 purificat es va dialitzar durant la nit contra fosfat de sodi 10 mM, pH 7,4 i NaF 150 mM i es va diluir a 0,16 mg/mL abans de l'anàlisi per espectroscòpia CD.L'exploració espectral de CD amb una longitud d'ona de 185 a 260 nm es va recollir en un espectropolarimetre Jasco J-1500 mitjançant cubetes de quars amb una longitud de camí òptic d'1 mm (Helma) a 25 ° C a una velocitat de 50 nm/min.Els espectres CD es van corregir a la línia de base, es van fer una mitjana de 10 adquisicions i es van convertir en el·lipticitat residual mitjana (θMRE) en graus cm2/dmol:
on MW és el pes molecular de cada mostra en Da;N és el nombre d'aminoàcids;θ és l'el·lipticitat en mil·ligraus;d correspon a la longitud del camí òptic en cm;concentració de proteïnes en unitats.