Component químic de tubs enrotllats d'acer inoxidable de 310 10 * 1 mm, els dominis N-terminals de l'espidroïna formen hidrogels basats en fibril·les amiloides i proporcionen una plataforma per a la immobilització de proteïnes.

Gràcies per visitar Nature.com.Esteu utilitzant una versió del navegador amb suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).A més, per garantir un suport permanent, mostrem el lloc sense estils ni JavaScript.
Controls lliscants que mostren tres articles per diapositiva.Utilitzeu els botons enrere i següent per moure's per les diapositives, o els botons del controlador de diapositives al final per moure's per cada diapositiva.

Especificació

Proveïdors de tubs enrotllats d'acer inoxidable de 310 10 * 1 mm

Composició química

Propietats mecàniques

Les proteïnes de seda d'aranya recombinants (proteïnes de seda d'aranya) tenen moltes aplicacions potencials en el desenvolupament de nous biomaterials, però la seva naturalesa multimodal i propensa a l'agregació les fa difícils d'obtenir i fàcils d'utilitzar.Aquí informem que les proteïnes espidroïnes en miniatura recombinants i, sobretot, el propi domini N-terminal (NT) formen ràpidament hidrogels transparents i autosuficients a 37 ° C.les proteïnes de fusió que consisteixen en NT i proteïna fluorescent verda o purina nucleòsid fosforilasa formen proteïnes de fusió totalment funcionals.Hidrogels.Els nostres resultats mostren que les proteïnes recombinants NT i de fusió proporcionen alts rendiments d'expressió i doten als hidrogels de propietats atractives com ara la transparència, la gelificació sense reticulació i la immobilització directa de proteïnes actives a alta densitat.
Les aranyes tenen fins a set conjunts diferents de glàndules de seda, cadascuna produint un tipus específic de seda.Les set espècies de seda estan compostes per proteïnes de seda d'aranya (spidroins) d'aproximadament 6000 residus de llarg i contenen una gran regió central repetida envoltada de dominis esfèrics N i C-terminals (NT i CT)1,2.El tipus de seda més estudiat, l'ampolla primària, és produïda per la glàndula ampolla primària.En aquesta glàndula, una monocapa de cèl·lules epitelials sintetitza proteïnes spidroïna i les secreta al lumen de la glàndula, on estan presents en forma soluble (dopatge) a concentracions extremadament altes (30-50% p/v)3,4.S'ha debatut l'organització i conformació de les principals proteïnes spidroïna ampullar a la glàndula, però la majoria d'evidències experimentals indiquen la presència d'una conformació helicoïdal generalment helicoïdal i/o aleatòria i d'estructures micel·lars o lamel·lars5,6,7,8,9,10.Mentre que els dominis repetitius regulen les propietats mecàniques de les fibres de seda, formant nanocristalls de fulla β i estructures amorfes11,12,13,14,15, els dominis finals regulen les fibres de seda en resposta a les condicions canviants al llarg de la glàndula de la seda16,17,18.Controlant la formació de la seda, 19. Els dominis terminals es conserven evolutivament i la seva funció pot ser comuna a totes les proteïnes spidroin 2,20,21.Durant el pas per la glàndula, el pH de l'espidroïna disminueix d'uns 7,6 a <5,716 i augmenta amb el cisallament i l'estirament mediat pel moviment a través del conducte que s'estreny gradualment.En solució, la TC és un dímer paral·lel constitutiu helicoïdal α17, però en resposta a forces de tall i pH baixes, la TC es desplega i canvia les capes β16, 17, possiblement desencadenant capes β a les regions repetitives de Convert 16. NT són monomèrics sota condicions que reflecteixen les condicions a la llum de la glàndula i medien la solubilitat de l'espidroïna, però a pH reduït, la protonació d'una sèrie de cadenes laterals d'àcid carboxílic condueix a la dimerització de NT amb un pKa d'aproximadament 6,5, estabilitzant així NT i fixant l'espidroïna en grans dimensions. quantitats.xarxes16,18.Així, NT té un paper clau en la formació del filament, passant d'un monòmer en el recobriment a un dímer a la fibra23,24,25.La NT continua sent altament soluble i helicoïdal en totes les condicions estudiades fins ara16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, cosa que va inspirar el seu desenvolupament com a etiqueta que millora la solubilitat per a la producció de proteïnes heteròlogues.
La proteïna de seda d'aranya recombinant, que consta d'un NT, una regió de repetició curta, un CT i una etiqueta His6 (His-NT2RepCT) per a la purificació, és tan soluble en tampó aquós com la proteïna de seda d'aranya nativa i imita les característiques importants natives de l'aranya de seda. .cobertura 25.31.His-NT2RepCT es pot filar en fibres contínues mitjançant una màquina biomimètica en la qual s'extrudeix un recobriment soluble de pH 8 en un bany d'aigua de pH 525,32,33,34,35.La fermentació del bioreactor d'E. coli que expressava His-NT2RepCT i el posttractament posterior va donar lloc a un rendiment > 14 g/L després de la purificació.L'alt rendiment, l'alta solubilitat i la resposta adequada de His-NT2RepCT a condicions àcides s'atribueixen a NT23, 25, 34.
Aquí informem de la ràpida formació d'hidrogels transparents a partir de proteïnes d'espidroïna recombinant, inclosa només NT, incubant una solució de proteïnes a 37 ° C.Utilitzant la fluorescència de tioflavina T (ThT), l'espectroscòpia infraroja de transformada de Fourier (FTIR), l'espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear (RMN) i la microscòpia electrònica de transmissió (TEM), vam trobar que les proteïnes NT i microspider experimenten una transformació estructural en làmines β i fibril·les semblants a l'amiloide. quan es formen gels.A més, les proteïnes de fusió de NT i la proteïna fluorescent verda (GFP) o la purina nucleòsid fosforilasa (PNP) formen hidrogels amb fragments de fusió totalment funcionals.L'expressió d'alt rendiment en hostes heteròlegs, juntament amb la formació ràpida d'hidrogels en condicions fisiològiques, obre la possibilitat d'una producció rendible d'hidrogels amb funcions dissenyades.
A diferència de la majoria de proteïnes espidroïnes recombinants informades36, His-NT2RepCT és estable al tampó Tris-HCl a pH 8 i es pot concentrar fins a 500 mg/ml sense precipitació25.Per tant, ens va sorprendre trobar que aquesta proteïna forma ràpidament hidrogels òpticament clars i autosuficients quan s'incuba a 37 ° C (Fig. 1b-d).Estudis posteriors van demostrar que la gelificació His-NT2RepCT es va produir en una àmplia gamma de concentracions de proteïnes (10-300 mg/ml) i que aquesta concentració estava inversament correlacionada amb el temps de gelificació (Fig. 1c i Fig. 1 suplementària).Per esbrinar quines parts de His-NT2RepCT medien la formació d'hidrogel, després vam examinar cada domini individualment i en diverses combinacions mitjançant un assaig d'inversió de matràs (figura 1a, b).Totes les fraccions provades d'espidroïna recombinant van formar gels (a una concentració de proteïnes de 300 mg/ml) en menys d'1 h, excepte el 2Rep precipitat (Fig. 1b).Això suggereix que NT i CT sols, en combinació o associats a repeticions, poden gelificar a 37 ° C i que l'etiqueta His6 no afecta aquest procés de manera significativa.Tenint en compte la noció comuna que NT és una proteïna altament soluble i estable, i que els informes anteriors d'hidrogels d'espidroïna recombinants han atribuït efectes de gelificació als canvis conformacionals en regions repetides i/o CT, el mateix NT podria.El descobriment de la gelificació va ser inesperat.Taula suplementària 1) 37, 38, 39. Notablement, NT ja es va gelificar en 10 minuts a una concentració ≥ 300 mg/ml (Fig. 1c).Els experiments d'inversió de vials amb diverses concentracions de NT van demostrar que a> 50 mg/mL la solució de NT es va gelificar més ràpidament que His-NT2RepCT a la concentració corresponent (p/v, figura 1c).
Representació esquemàtica de diferents construccions d'espidroïna estudiades en aquest treball.b Temps de gel a 37 °C per a diverses proteïnes spidroïna recombinants (300 mg/mL) verificat invertint el vial.Gel CT immediatament sense incubació (<300 mg/mL), precipitats 2Rep (300 mg/mL, escala de 5 mm).c Temps de gel de His-NT2RepCT i NT a les concentracions de proteïnes indicades a 37 °C.d Fotografies d'hidrogels His-NT2RepCT i NT amb l'aranya i la lletra "NT" impreses a sota, respectivament (ambdós 200 mg/mL, barra d'escala 5 mm).
Els hidrogels formats per diverses proteïnes d'espidroïna recombinants tenen colors lleugerament diferents i l'observació a ull nu mostra diferents graus de transparència (Fig. 1b).Els gels NT són excepcionalment clars, mentre que altres gels es tornen opacs.Els gels His-NT2RepCT i NT colats en tubs cilíndrics es podrien treure del motlle intactes (Fig. 1d).
Per provar si els recobriments naturals de seda d'aranya gelen en condicions que ara causen la gelificació de les proteïnes d'espidroïna recombinant, es van recollir recobriments de la gran glàndula ampolla de l'aranya pont sueca (Larinioides sclopetarius).Els recobriments es van emmagatzemar en tampó Tris-HCl de 20 mM a 50 mg/mL (basat en el pes sec mesurat), però no es va observar cap gelificació durant la incubació de 21 dies a 37 ° C (figura suplementària 2a).
Per quantificar aquests gels, es poden utilitzar mesures reològiques per estudiar el procés de gelificació i determinar les propietats mecàniques globals.En particular, el seguiment del mòdul d'emmagatzematge (elasticitat) a temperatures elevades pot proporcionar informació sobre la temperatura de gelificació així com les propietats viscoelàstiques del recobriment.Els experiments d'augment de la temperatura (utilitzant 1 °C/min a 25-45 °C, basats en estudis anteriors amb solucions naturals de seda)40,41 van demostrar que els mòduls d'emmagatzematge de les solucions His-NT2RepCT i NT augmentaven amb l'augment de la temperatura.es va augmentar (Fig. 2 i Fig. 3 suplementària).En particular, el mòdul NT va començar a créixer a una temperatura més baixa en comparació amb His-NT2RepCT, d'acord amb el temps de gel més ràpid observat quan NT es va incubar directament amb His-NT2RepCT a 37 ° C (figura 1).Després d'una caiguda posterior de la temperatura, el mòdul d'emmagatzematge no va tornar a valors més baixos i es va mantenir per sobre del mòdul de pèrdua (vegeu la figura suplementària 3), cosa que indica una gelificació estable tèrmicament irreversible.Després de la gelificació, el mòdul elàstic final va oscil·lar entre 15 i 330 kPa per als hidrogels His-NT2RepCT a una concentració de 100-500 mg/mL, i el mòdul elàstic final per als hidrogels NT (100-500 mg/mL) va oscil·lar entre 2 i 1400. kPa (Fig. 2 i dades completes de la rampa) vegeu la figura suplementària 3).
a Canvi de temperatura durant les mesures de His-NT2RepCT (300 mg/mL) i b NT (300 mg/mL) amb agitació.Les fletxes indiquen la tendència de la temperatura i l'ombrejat més clar de les dades del mòdul d'emmagatzematge representa la prova amb valors de parell inferiors als especificats pel fabricant, que és la causa de l'augment del soroll.c Acumulació del mòdul final de His-NT2RepCT i NT després d'una temperatura elevada (100, 300 i 500 mg/mL).Totes les lectures del mòdul es fan a una freqüència de 0,1 Hz.
Com a mètode potencial per investigar els canvis conformacionals associats a la gelificació, vam registrar espectres FTIR de His-NT2RepCT i NT abans i després de la gelificació a 37 ° C (figura 3a, b).Com era d'esperar, els espectres de les solucions His-NT2RepCT i NT corresponien a proteïnes que mostraven una estructura secundària α-hèlix/bobina aleatòria, amb una banda pronunciada a 1645 cm-1.Per als dos hidrogels, la gelificació va donar lloc a la formació de dos braços a la banda I central a uns 1617 cm-1 i 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), cosa que indica la formació d'estructures de fulls β antiparal·lels.Aquests canvis també es poden veure clarament en els respectius espectres de gelació de la segona derivada i la diferència (figura suplementària 4b).Les dues bandes de la capa NT β eren més pronunciades que les de His-NT2RepCT, cosa que indica que el contingut total de bandes de la capa β a l'hidrogel NT era superior al de l'hidrogel NT2RepCT.
a espectres d'absorció FTIR de His-NT2RepCT i b NT (ambdós 500 mg/mL) abans (solució) i després d'incubació (gel) a 37 °C.c Imatges TEM de gels NT2RepCT de 50 mg/ml resuspesos i d NT.Barra d'escala 200 nm.e Diàmetres de fibra dels hidrogels His-NT2RepCT i NT.n = 100 fibrils mesurades, p < 0,0001.Les barres d'error mostren la desviació estàndard.El centre de les barres d'error és la mitjana.Es va utilitzar una prova t no aparellada (de dues cues) per a l'anàlisi estadística.f Fluorescència ThT de diverses proteïnes spidroïna recombinants (100 mg/mL) a 37 ° C sense sacsejar.g Experiments d'inoculació de NT (100 mg/mL) a partir de gel NT de 100 mg/mL amb 0%, 5%, 10% i 20% de llavors.
L'anàlisi del gel mitjançant microscòpia electrònica de transmissió (TEM) va mostrar que l'hidrogel consta de fibrilles semblants a l'amiloide (Figs. 3c, 3d).Les fibrilles formades per NT eren allargades (de 5 a 12 nm de diàmetre) i no ramificades, mentre que les fibril·les His-NT2RepCT eren de longitud més curta i significativament més amples de diàmetre (7-16 nm) (Fig. 3e).Aquests resultats ens van permetre seguir la cinètica de la fibrosi mitjançant l'assaig de tioflavina T (ThT).Per a totes les proteïnes spidroin recombinants, el senyal fluorescent va augmentar quan les mostres es van incubar a 37 ° C (figura 3f, figura suplementària 5a).D'acord amb aquesta troballa, l'examen microscòpic de NT i His-NT2RepCT en condicions de gelificació va revelar un augment uniforme de la fluorescència ThT sense una acumulació local notable d'agregats ThT positius (figura suplementària 5b, c).La formació de fibrils ThT positives no va anar acompanyada d'un augment de la terbolesa de NT i His-NTCT (figura suplementària 5d), cosa que significa que es podria formar una xarxa de fibrilles al gel sense comprometre la claredat del gel.La sembra afegint petites quantitats de fibril·les preformades pot accelerar significativament la formació de fibril·les d'alguns amiloides42,43,44 però afegint un 5%, 10% o 20% (p/p) de NT a una solució d'hidrocoagulants NT.efecte de sembra (Fig. 3g).Potser això es deu al fet que les fibrilles de l'hidrogel estan relativament fixes i no es poden utilitzar com a llavors.
El comportament inesperat de les proteïnes spidroïna recombinants a altes temperatures va provocar més estudis d'espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear (RMN) per identificar els canvis conformacionals associats a la formació de gel.Els espectres de RMN de les solucions His-NT2RepCT registrades al llarg del temps a 37 °C van mostrar que la TC encara estava parcialment plegada, mentre que els senyals NT i 2Rep havien desaparegut (Fig. 4a), cosa que suggereix que era principalment NT i 2Rep els que controlaven parcialment la formació de His- Hidrogel NT2RepCT.El senyal de TC també es va atenuar al 20% de la seva intensitat original, cosa que suggereix que la TC també està majoritàriament fixada i incorporada a l'estructura d'hidrogel.Per a una part més petita de la TC, que és tan mòbil com a la mostra preincubada i, per tant, observada per RMN de solució, els espectres no tenen senyals per als 10 primers residus estructurats, possiblement a causa de la difícil immobilització de la part adjunta de His-NT2Rep.Els espectres de RMN de l'estat dels hidrogels -NT2RepCT van revelar la presència predominant d'hèlix α i capes β i, en menor mesura, la conformació de la bobina aleatòria (Fig. 4b).L'anàlisi del canvi químic dels residus de metionina presents només a NT va mostrar que aquest domini s'havia convertit en una estructura de fulla β.Els espectres depenents del temps de NT en solució van mostrar una disminució uniforme de la intensitat del senyal (Fig. 4c) i la RMN en estat sòlid dels hidrogels de NT va mostrar que la majoria dels residus de NT es van convertir en estructures de fulla β (Fig. 4d).La conformació de 2Rep no es va poder determinar per separat a causa de la seva tendència a agregar-se.Tanmateix, els espectres de RMN en estat sòlid dels hidrogels NTCT i His-NT2RepCT semblaven molt similars (Fig. 4b; Fig. 6b suplementària), cosa que suggereix que 2Rep va contribuir poc a la part estructural de l'hidrogel His-NT2RepCT.Per als hidrogels CT, es va trobar que hi havia hèlixs α, làmines β i estructures secundàries helicoïdals aleatòries (figura suplementària 6d).Això suggereix que algunes parts del CT continuen sent hèlixs α mentre que altres es converteixen en làmines β.Així, els resultats de l'espectroscòpia RMN suggereixen que NT és important per a la formació d'hidrogel i també es transforma en una conformació de fulla β després de la fusió amb 2Rep i CT.D'acord amb això, recentment hem trobat que les cremalleres espacials amiloides probablement es formen a les cinc hèlixs del domini NT, i l'algoritme de Waltz va predir una regió amiloidogènica a l'hèlix 1 (Fig. 4e).
Espectres 2D de la solució His-NT2RepCT 15N-HSQC 10 mg/mL abans (blau) i 19 hores després de la incubació (vermell) a 37 °C.Els pics creuats individuals a l'espectre vermell i F24, G136, polyA a l'espectre blau es denoten amb símbols d'aminoàcids d'una sola lletra i números de residus.Les insercions mostren la dependència de la intensitat del senyal en el temps per als residus seleccionats dels dominis NT, 2Rep i CT.b Espectres de radiofreqüència en estat sòlid (RFDR) dels hidrogels His-NT2RepCT.Les correlacions dels residus de Cα/Cβ observats en els espectres RFDR es van determinar mitjançant la comparació amb els canvis químics del pèptid model i els valors derivats de les estadístiques82,83 i les seves estructures secundàries.SSB: banda lateral giratòria.c Espectres unidimensionals de la solució NT 15N-HSQC 10 mg/mL durant la incubació a 37 °C durant 36 hores.El requadre mostra la intensitat volumètrica en funció del temps.d Espectres RFDR d'estat sòlid d'hidrogels NT.S'indiquen les correlacions de residus Cα/Cβ i les seves estructures secundàries observades als espectres RFDR.e Basat en el perfil de propensió a la fibril·lació NT45.79 de la base de dades Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).L'energia de Rosetta de la finestra de desplaçament del llamp espacial de l'hexapèptid es mostra en kcal/mol.Les barres vermelles denoten hexapèptids amb una alta propensió a la fibrosi (energia Rosetta per sota de -23 kcal/mol; per sota de la línia de punts).Les barres verdes indiquen fragments amb energies Rosetta per sobre del llindar i, per tant, menys propensos a formar cremalleres estèriques.Els fragments que contenien prolina es van excloure de l'anàlisi (sense columnes).Els quadrats indiquen àrees d'amiloïdosi predites per l'algoritme Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).La seqüència de residus d'aminoàcids de NT es troba a la part superior i els tipus de residus que es troben a l'estructura secundària β (determinats per espectroscòpia de RMN d'estat sòlid) es mostren en vermell.Les posicions de les cinc hèlixs α NT es designen com (H1-H5)28.
A pH <6,5, l'HT es dimeritza, sent resistent a la desnaturalització induïda per la calor o la urea18.Per dilucidar com la dimerització i l'estabilitat de NT afecten la gelificació, es van controlar solucions que contenien 100 mg/ml de NT a pH 8, 7 i 6 mitjançant la prova d'inversió del vial.Les mostres de NT incubades a pH 8 i 7 es van gelificar després de 30 min a 37 ° C, però el gel de pH 8 es va mantenir clar, mentre que el gel de pH 7 va mostrar un precipitat visible (Fig. 5a).En canvi, una solució que contenia HT a pH 6 no va formar un gel i es va poder veure un gran precipitat després de 20 min a 37 °C.Això suggereix que els propis dímers i/o la seva major estabilitat en comparació amb els monòmers eviten la gelificació.No s'esperava la formació d'un precipitat per a NT a pH 7 i 6, ja que s'ha informat que NT és soluble a 200 mg/ml27, es replega fàcilment després de la desnaturalització per calor i també conserva una hèlix α a valors més baixos de pH 18. Una explicació probable d'aquestes discrepàncies és que els experiments reportats anteriorment es van dur a terme a temperatura ambient o per sota, o a concentracions de proteïnes relativament baixes16,18,19.
Prova d'inversió de vial NT (100 mg/mL) a pH 8, 7, 6 i NaCl 154 mM (pH 8) després d'incubació a 37 °C.b Espectres NT CD amb i sense 154 mM NaF i 154 mM NaCl, respectivament.L'el·lipticitat molar a 222 nm es converteix en una proporció de plecs naturals.c Assaig d'inversió NT (100 mg/mL) NT* (37 °C i 60 °C), NTA72R (37 °C) i His-NT-L6 (37 °C i 60 °C).d Espectres CD dels mutants NT NT*, NTA72R i His-NT-L6.L'el·lipticitat molar a 222 nm es converteix en una proporció de plecs naturals.e Prova d'inversió de NTFlSp, NTMiSp i NTMiSp reduït (100 mg/mL).Barra d'escala 5 mm.f espectres CD de NT, NTFlSp, NTMiSp i NTMiSp reduït.L'el·lipticitat molar a 222 nm es converteix en una proporció de plecs naturals.A la figura suplementària 8 es mostren els espectres NT complets a 25 ° C i 95 ° C.
La concentració fisiològica de sal determina les interaccions electrostàtiques entre les subunitats de NT i la dimerització de la transferència de NT a pH18 més baix.Hem trobat que la presència de 154 mM de NaCl i NaF va inhibir la gelificació, respectivament (Fig. 5a, b; Fig. 2b suplementària) i que aquestes sals van augmentar l'estabilitat tèrmica dels monòmers NT (Fig. 5b, Fig. 8 suplementària). .També suggereix que la millora de l'estabilitat, en lloc de la dimerització, prevé la formació de gel.
Per explorar més el paper de la dimerització i l'estabilitat de proteïnes en la gelificació, vam utilitzar dos mutants, NT * i NTA72R, que també romanen monomèrics a pH 28,30 baix.NT* és un mutant d'inversió de càrrega doble en el qual la distribució aparent de càrrega dipolar del monòmer s'aplana, la qual cosa evita la dimerització i augmenta dràsticament l'estabilitat del monòmer.NTA72R és un dipol carregat, però Ala substituït per Arg es troba al límit del dímer, de manera que les mutacions interfereixen amb les interaccions de subunitats necessàries per a la dimerització.En incubar a 37 ° C, NT * no va formar un hidrogel, mentre que NTA72R va formar un gel opac durant 15 min (Fig. 5c).Com que tant NT * com NTA72R no poden dimeritzar-se, però difereixen en l'estabilitat dels monòmers (Fig. 5d), aquests resultats suggereixen fortament que una alta estabilitat termodinàmica impedeix que NT es gelifiqui.Això també es recolza en el fet que HT* forma un gel quan és inestable a alta temperatura (després de 8 min a 60 °C; Fig. 5c).Anteriorment s'ha demostrat que l'alt contingut de metionina a NT liqua el seu plegament natural i que sis substituts de Met a Leu (anomenats aquí His-NT-L6) estabilitzen fortament el monòmer NT46.Partint del supòsit que es requereix flexibilitat estructural per a la formació de gel NT, vam trobar que el mutant estable His-NT-L6 no es va gelificar a 37 ° C (figura 5c, d).Tanmateix, His-NT-L6 també va formar un gel després de la incubació a 60 ° С durant 60 min (Fig. 5c).
La capacitat de NT per transformar-se en estructures de fulla β i formar hidrogels sembla aplicar-se a alguns, però no a tots, els dominis NT de l'espidroïna.Els NT de diferents tipus de seda i espècies d'aranya, Trichonephila clavipes (NTFlSp), van formar gels malgrat el seu contingut relativament baix de metionina i l'alta estabilitat tèrmica (Fig. 5e, f i taula suplementària 2).En canvi, NT de la petita proteïna ampullar spidroin d'Araneus ventricosus (NTMiSp) amb baixa estabilitat tèrmica i alt contingut en metionina no va formar hidrogels (taula suplementària 2 i figura 5e, f).Aquest últim pot estar associat a la presència d'enllaços disulfur intramoleculars29,47.De manera consistent, quan es van reduir els enllaços disulfur de NTMiSp, va formar un hidrogel després de la incubació a 37 ° C durant 10 min (Fig. 5e).En conclusió, cal assenyalar que la flexibilitat estructural és un criteri important, però no l'únic, per a la formació d'un gel a partir de NT.Un altre factor que pot ser rellevant és la propensió a formar fibril·les amiloides, i l'anàlisi amb la base de dades de cremallera i l'algoritme Waltz va mostrar una correlació entre la capacitat de formar gels i la presència de regions amiloidogèniques, així com l'extensió de les regions predites. per formar cremalleres estèriques.Hi va haver una correlació (taula suplementària 2 i figura suplementària 9).
La capacitat de NT per formar fibrilles i formar gels en condicions favorables ens va portar a plantejar la hipòtesi que les fusions de NT amb altres fragments de proteïnes encara poden formar gels amb la funció completa dels socis de fusió.Per provar-ho, vam introduir proteïna fluorescent verda (GFP) i purina nucleòsid fosforilasa (PNP) a l'extrem C-terminal de la NT, respectivament.Les proteïnes de fusió resultants es van expressar en E. coli amb rendiments finals molt elevats (cultius de matràs agitats de 150 mg/L i 256 mg/L per a His-NT-GFP i His-NT-PNP, respectivament), d'acord amb el que s'ha demostrat. per a Altres proteïnes fusionades a NT Ref.30. Les proteïnes de fusió His-NT-GFP (300mg/mL) i His-NT-PNP (100mg/mL) van formar gels després de 2 hores i 6,5 hores a 37 °C i, sobretot, la fracció GFP es va mantenir sense canvis.observat després de la gelificació, amb> 70% de la intensitat de fluorescència inicial restant després de la gelificació (Fig. 6a).Per mesurar l'activitat de PNP en solucions i gels his-NT-PNP, vam haver de diluir la proteïna de fusió amb NT perquè l'activitat enzimàtica de la preparació pura estava fora del rang de detecció de l'assaig a concentracions de gelificació.El gel format amb una barreja que contenia 0, 01 mg/mL His-NT-PNP i 100 mg/mL NT va retenir el 65% de l'activitat enzimàtica inicial de les mostres preincubades (Fig. 6b).El gel es va mantenir intacte durant la mesura (figura suplementària 10).
a Intensitat de fluorescència relativa abans i després de la gelificació de His-NT-GFP (300 mg/mL) i vial invertit que conté hidrogel His-NT-GFP (300 mg/mL) sota llum visible i UV.Els punts mostren mesures individuals (n = 3), les barres d'error mostren la desviació estàndard.El valor mitjà es mostra al centre de les barres d'error.b L'activitat PNP es va obtenir mitjançant anàlisi fluoromètrica utilitzant solucions i gels consistents en NT (100 mg/ml) i una barreja que contenia 0,01 mg/ml his-NT-PNP i 100 mg/ml nous dòlars de Taiwan.El requadre mostra un vial invertit que conté un hidrogel que conté His-NT-PNP (barra d'escala de 5 mm).
Aquí, informem de la formació d'hidrogels a partir de NT i altres proteïnes spidroïnes recombinants incubant una solució de proteïnes a 37 ° C (figura 1).Mostrem que la gelificació s'associa amb la transformació de les hèlixs α en capes β i la formació de fibril·les semblants a l'amiloide (Figs. 3 i 4).Aquesta troballa és sorprenent, ja que els NT són paquets globulars de cinc hèlixs enrotllats coneguts per la seva solubilitat extremadament alta i alta estabilitat a concentracions> 200 mg/mL a 4 ° C durant diversos dies27.A més, els NT es repleguen fàcilment després de la desnaturalització per calor a baixes concentracions de proteïnes en µM.Segons els nostres resultats, la formació de fibril·les requereix una combinació de concentració de proteïnes > 10 mg/ml i una temperatura lleugerament elevada (Fig. 1).Això és coherent amb la idea que les fibrils amiloides es poden formar a partir de proteïnes plegades globularment que es troben en un estat parcialment desplegat a causa de les fluctuacions tèrmiques en condicions fisiològiques 48 .Alguns exemples de proteïnes que pateixen aquesta conversió inclouen la insulina49,50, la β2-microglobulina, la transtiretina i el lisozima51,52,53.Tot i que NT és una hèlix α en el seu estat natiu, aproximadament el 65% de la cadena polipeptídica és compatible amb la formació de cremallera estèrica (Fig. 4e) 45 .Com que el monòmer és dinàmicament mòbil46, pot exposar aquestes regions amiloidogèniques potencials a temperatures moderadament elevades i a altes concentracions de proteïna total pot arribar a una concentració crítica per a la formació de fibril·les amiloides54.Seguint aquest raonament, hem trobat una correlació negativa entre la concentració d'espidroïna i el temps de gelificació (Fig. 1c), i si la conformació monomèrica de NT s'estabilitza ja sigui per mutacions (NT*, His-NT-L6) o per addició de sal, es pot prevenir la hidrogels de formació (Fig. 5).
En la majoria dels casos, les fibrilles d'amiloide desapareixen de la solució com a precipitat, però en determinades condicions poden formar hidrogels55,56,57.Les fibril·les que formen hidrogel solen tenir una relació d'aspecte elevada i formen xarxes tridimensionals estables mitjançant l'entrellat molecular,55,58 d'acord amb els nostres resultats.Per a la formació d'hidrogels in vitro, les proteïnes sovint es despleguen total o parcialment, per exemple, per exposició a dissolvents orgànics, temperatura elevada (70-90 °C) i/o pH baix (1,5-3,0)59,60,61,62.Els hidrogels de spidroin descrits aquí no requereixen un processament dur, ni requereixen agents de reticulació per estabilitzar els hidrogels.
S'ha informat anteriorment que les repeticions d'espidroïna i els QD, que semblen patir un canvi de fulls β durant la filatura de la seda, formen hidrogels.En comparació amb les nostres troballes, els temps d'incubació i/o les temperatures d'incubació eren significativament més llargs o més alts, respectivament, i els hidrogels resultants sovint eren opacs (figura 7 i taula suplementària 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68. , 69. A més dels temps de gel ràpids, els hidrogels NT >300 mg/ml (30%) van superar tots els altres hidrogels de proteïna de seda d'aranya recombinants descrits, així com els hidrogels naturals com la gelatina, l'alginat (2%), l'agar (0,5%). ) i col·lagen.(0,6%) (Figura 7 i taules complementàries 1 i 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
El temps de gel i el mòdul elàstic dels hidrogels d'aquest estudi es van comparar amb altres hidrogels a base d'espidroïna i hidrogels naturals seleccionats.Es donen referències juntament amb una descripció de les condicions de gelificació.APS Persulfat d'amoni, temperatura ambient.Dades 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Sembla que les aranyes han desenvolupat maneres d'evitar que l'espidroïna es gelifiqui durant l'emmagatzematge.Malgrat l'alta concentració de proteïnes a la glàndula de la seda, la gran regió de repetició associada al domini terminal significa que la concentració aparent de NT i CT a la glàndula correspon a aproximadament 10-20 mg/ml, al límit d'aquest estudi.necessari per a la formació d'hidrogel observada in vitro.A més, concentracions similars de sals 16 van estabilitzar NT, com a les glàndules de la seda (Fig. 5b).S'ha estudiat la conformació de NT al citosol d'E. coli i s'ha trobat que està més fortament plegada que quan s'examina in vitro, la qual cosa indica a més que la sal o altres factors impedeixen la seva agregació in vivo.Tanmateix, la capacitat dels NT per transformar-se en fibrils de fulla β pot ser important per a la formació de filaments i s'hauria d'investigar en estudis futurs.
A més dels nous aspectes de la formació de fibril·les i hidrogels semblants a NT-amiloide observats en aquest estudi, també mostrem que aquest fenomen pot tenir aplicacions biotecnològiques i biomèdiques (Fig. 8).Com a prova de concepte, vam combinar NT amb GFP o PNP i vam demostrar que la proteïna de fusió també forma hidrogels quan s'incuba a 37 ° C i que les fraccions GFP i PNP conserven en gran part la seva activitat després de la gelificació (figura 6).Les fosforilasis de nucleòsids són importants catalitzadors de síntesi d'anàlegs de nucleòsids75, cosa que fa que el nostre descobriment sigui rellevant per a la indústria biofarmacèutica.El concepte d'expressar proteïnes de fusió que formen hidrogels transparents en condicions favorables permet la creació d'hidrogels funcionalitzats amb propietats favorables per a una àmplia gamma d'aplicacions com la immobilització d'enzims, l'alliberament controlat de fàrmacs i l'enginyeria de teixits.A més, NT i NT * són marcadors d'expressió eficients30, cosa que significa que NT i les seves variants es poden utilitzar per a la producció d'alt rendiment de proteïnes de fusió solubles i la posterior creació de proteïnes diana immobilitzades en hidrogels 3D.
El NT és soluble, helicoïdal α i estable a concentracions baixes (µM) i 37 °C.A la mateixa temperatura, però a concentracions creixents (> 10 mg/ml), NT forma gels formats per fibrilles semblants a l'amiloide.Les proteïnes de fusió NT també formen gels fibril·lars amb fragments de fusió totalment funcionals, cosa que permet immobilitzar diverses proteïnes en hidrogels 3D mitjançant NT.A baix: NT (PDB: 4FBS) i il·lustracions de xarxes de fibra i estructures de proteïnes associades (assumptes i no dibuixades a escala, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Les construccions (vegeu la taula suplementària 4 per obtenir una llista completa que inclou seqüències d'aminoàcids) es van clonar al plasmidi pT7 i es van transformar en E. coli BL21 (DE3).E. coli que contenia plasmidis modificats es va inocular en brou Luria suplementat amb kanamicina (70 mg/l) i es va fer créixer durant la nit a 30 ° C i 250 rpm.A continuació, es va inocular el cultiu 1/100 en medi LB que contenia kanamicina i es va cultivar a 30 ° C i 110 rpm fins que la DO600 va arribar a 0, 8.Per als estudis de RMN, es van cultivar bacteris en un medi mínim M9 que contenia 2 g de D-glucosa 13C (Aldrich) i 1 g de clorur d'amoni 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) per a l'etiquetatge de proteïnes amb isòtops.Baixeu la temperatura a 20 graus centígrads i induïu l'expressió de proteïnes amb isopropiltiogalactopiranòsid 0,15 mM (concentració final).Després de l'expressió de proteïnes durant la nit, les cèl·lules es van recollir a 7278 × g, 4 ° C durant 20 min.Els pellets de cèl·lules es van tornar a suspendre en Tris-HCl 20 mM, pH 8 i es van congelar fins a un nou ús.Les cèl·lules descongelades es van lisar mitjançant un disruptor cel·lular (màquines de la sèrie TS, Constant Systems Limited, Anglaterra) a 30 kPa.A continuació, els lisats es van centrifugar a 25.000 g durant 30 minuts a 4 °C.Per a NTMiSp, el pellet es va tornar a suspendre en urea 2 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8, i es va sonicar durant 2 min (2 s encès/apagat, 65%), després es va centrifugar de nou a 25.000 xg, 4 ° C. 30 min.El sobrenedant es va carregar en una columna de Ni-NTA, es va rentar amb Tris-HCl 20 mM, imidazol 2 mM, pH 8, i finalment la proteïna es va eluir amb Tris-HCl 20 mM, imidazol 200 mM, pH 8. Per generar NT2RepCT i NTCT, la digestió de la trombina introdueix el lloc (ThrCleav) entre His i NT.Els llocs d'escissió de la trombina també estan presents a His-NT-ThrCleav-2Rep (produeix 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (produeix NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (produeix CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (produeix NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produeix NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produeix NTF1Sp) i His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produeix NTMiSp).Les construccions es van digerir amb trombina (1:1000) i es van dialitzar durant la nit a 4 °C amb Tris-HCl 20 mM, pH 8, utilitzant una membrana de diàlisi Spectra/Por amb un llindar de pes molecular de 6-8 kDa.Després de la diàlisi, la solució es carrega en una columna de Ni-NTA i es recull l'efluent que conté la proteïna d'interès.Les concentracions de proteïnes es van determinar mesurant l'absorbància UV a 280 nm mitjançant el coeficient d'extinció de cada proteïna, excepte NTF1Sp, que va utilitzar l'assaig de Bradford segons el protocol del fabricant.La puresa es va determinar mitjançant electroforesi en gel de poliacrilamida SDS (4-20%) i tinció de blau brillant de Coomassie.Les proteïnes es van concentrar mitjançant filtres de centrífuga (VivaSpin 20, GE Healthcare) a 4000 xg amb un tall de pes molecular de 10 kDa en cicles de 20 minuts.
Descongela la solució de proteïnes i pipeta amb cura 150 µl en un vial transparent d'1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Els tubs es van tapar i segellar amb parafilm per evitar l'evaporació.Les mostres (n = 3) es van incubar a 37 °C o 60 °C i es van invertir periòdicament per observar la gelificació.Les mostres que no es van gelificar es van incubar durant almenys una setmana.Reduïu els enllaços disulfur NTMiSp amb 10 mM de DTT per 10 µM de proteïna.Per analitzar la gelificació dels recobriments de seda d'aranya natural, es va tallar l'aranya pont sueca, es van col·locar les dues glàndules ampullades principals en 200 μl de tampó Tris-HCl 20 mM pH 8 i es van tallar per permetre que el recobriment es separi de les glàndules..El contingut de les glàndules es dissol en tampó, 50 µl per a la determinació del pes sec (mitjançant la incubació de vials oberts a 60 °C fins a pes constant) i 150 µl per a la gelificació a 37 °C.
La geometria/eina de mesura està feta d'acer inoxidable mitjançant una placa paral·lela amb un diàmetre superior de 20 mm i un espai de 0,5 mm.Escalfeu la mostra de 25 °C a 45 °C i torna a 25 °C a una velocitat d'1 °C per minut utilitzant una placa Peltier inferior d'acer inoxidable.Les mesures vibracionals es van dur a terme a una freqüència de 0, 1 Hz i a la regió viscoelàstica lineal del material a una tensió del 5% i del 0, 5% per a mostres de 100 mg/mL i 300-500 mg/mL, respectivament.Utilitzeu una cambra d'humitat personalitzada per evitar l'evaporació.Les dades es van analitzar amb Prism 9.
Per recollir espectres infrarojos (IR) a temperatura ambient de 800 a 3900 cm–1.El dispositiu ATR, així com el recorregut de la llum a través de l'espectròmetre, es purguen amb aire filtrat sec abans i durant l'experiment.Es van pipetear solucions (500 mg/mL per minimitzar els pics d'absorció d'aigua en els espectres) als cristalls i es van formar gels (500 mg/mL) abans de la mesura i després es van transferir als cristalls (n = 3).Es van registrar 1000 exploracions amb una resolució de 2 cm-1 i un cicle de treball zero de 2. La segona derivada es va calcular mitjançant OPUS (Bruker) utilitzant un rang de suavització de nou punts.Els espectres es van normalitzar a la mateixa regió d'integració entre 1720 i 1580 cm-1 mitjançant F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".En l'espectroscòpia ATR-IR, la profunditat de penetració d'un feix infrarojo en una mostra depèn del nombre d'ona, donant lloc a una absorció més forta a números d'ona més baixos que a nombres d'ona més alts.Aquests efectes no s'han corregit per als espectres que es mostren a les Figs.3 perquè són molt petites (figura suplementària 4).Els espectres corregits per a aquesta figura es van calcular mitjançant el programari Bruker OPUS.
En principi, és possible una quantificació completa de les conformacions de proteïnes després d'una desconvolució fiable dels components dins del pic de l'amida I.Tanmateix, a la pràctica sorgeixen alguns obstacles.El soroll de l'espectre pot aparèixer com a pics (falsos) durant la deconvolució.A més, el pic degut a la flexió de l'aigua coincideix amb la posició del pic de l'amida I i pot tenir una magnitud similar per a mostres que contenen una gran quantitat d'aigua, com el gel aquós estudiat aquí.Per tant, no vam intentar descompondre completament el pic de l'amida I, i les nostres observacions només s'han de considerar en suport d'altres mètodes com l'espectroscòpia RMN.
Les solucions de 50 mg/ml NT i His-NT2RepCT es van gelificar durant la nit a 37 ° C.A continuació, es va diluir l'hidrogel amb Tris-HCl 20 mM (pH 8) a una concentració de 12, 5 mg/ml, es va agitar bé i es va pipetear per trencar el gel.A continuació, l'hidrogel es va diluir 10 vegades amb Tris-HCl 20 mM (pH 8), es van aplicar 5 μl de la mostra a una reixeta de coure recoberta amb formvar i es va eliminar l'excés de mostra amb paper secant.Les mostres es van rentar dues vegades amb 5 µl d'aigua MilliQ i es van tacar amb formiat d'uranil a l'1% durant 5 minuts.Traieu l'excés de taca amb paper absorbent, després assequeu la malla a l'aire.Les imatges es van realitzar en aquestes quadrícules utilitzant un FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN que funcionava a 100 kV.Les imatges es van gravar amb augments de x 26.500 i x 43.000 mitjançant una càmera CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Alemanya).Per a cada mostra (n = 1), es van registrar entre 10 i 15 imatges.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) es va utilitzar per a l'anàlisi d'imatges i la mesura dels diàmetres de fibres (n = 100, diferents fibres).Prism 9 es va utilitzar per realitzar proves t no aparellades (de dues cues).Les fibrilles his-NT2RepCT i NT mitjanes van ser d'11,43 (SD 2,035) i 7,67 (SD 1,389) nm, respectivament.L'interval de confiança (95%) és de -4,246 a -3,275.graus de llibertat = 198, p < 0,0001.
Es van mesurar 80 µl de mostres líquides que contenien 10 µM de tioflavina T (ThT) per triplicat (n = 3) en condicions estàtiques mitjançant plaques de fons transparents de fons negre Corning de 96 pous (Corning Glass 3881, EUA).Les diferències de fluorescència es van registrar mitjançant un filtre d'excitació de 440 nm i un filtre d'emissió de 480 nm (FLUOStar Galaxy de BMG Labtech, Offenburg, Alemanya).El senyal de ThT no es va saturar ni es va apagar, ja que es van realitzar experiments amb diferents concentracions de ThT sense canviar la intensitat del senyal.Registre l'absorbància a 360 nm per mesurar la boira.Per als experiments de sembra, es van formar gels de 100 mg/mL a 37 ° C, es van tornar a suspendre i es van utilitzar per sembrar amb proporcions molars del 5%, 10% i 20%.Les dades es van analitzar amb Prism 9.
Descongelar les existències d'His-NT2RepCT i NT> 100 mg/mL en gel i filtrar a través d'un filtre de 0,22 µm.Les concentracions es van calcular mesurant l'absorbància a 280 nm mitjançant Nanodrop.En pous d'una placa negra no vinculant de 96 pous (Corning) amb un fons transparent, les mostres es van diluir a 20 mg/ml en Tris-HCl 20 mM pH 8 i es van barrejar amb 5 μM ThT (concentració final), concentració total de mostra. 50 μl de volum.Les mostres es van fotografiar cada 10 minuts a 37 ° C en un microscopi CellObserver (Zeiss) amb canal de llum transmesa i conjunts de filtres d'excitació i emissió FITC per a imatges ThT.S'utilitza una lent de 20x/0,4 per a la imatge.Per a l'anàlisi d'imatges es van utilitzar Zen Blue (Zeiss) i ImageJ (https://imagej.nih.gov/).També es van preparar gels a partir de solucions NT i His-NT2RepCT a una concentració de 50 mg/mL que contenien 20 mM de Tris pH 8 i 5 µM ThT i es van incubar a 37 ° C durant 90 min.Les peces de gel es van transferir a un pou nou que contenia 20 mM de Tris, pH 8 i 5 μM de ThT en una placa de fons transparent de 96 pous negre no vinculant.Adquirir imatges de fluorescència verda i camp brillant amb un augment de 20x/0,4.ImageJ es va utilitzar per a l'anàlisi d'imatges.
Els espectres de RMN de solució es van obtenir a 310 K en un espectròmetre Bruker Avance Neo de 600 MHz equipat amb una criosonda de camp de gradient polsat de ressonància quadrupol (HFCN) QCI.Mostres de RMN que contenen 10 mg/mL de proteïna homogènia marcada amb 13C, 15N, dissolta en Tris-HCl 20 mM (pH 8), 0,02% (p/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Es van utilitzar desplaçaments químics de NT2RepCT a pH 6, 7 per assignar el pic 23 a l'espectre 2D de 15N-HSQC.
Els espectres de RMN sòlids de rotació d'angle màgic (MAS) d'hidrogels marcats amb 13C i 15N es van registrar en un espectròmetre Bruker Avance III HD a 800 MHz equipat amb una sonda sense electrons 13C/15N{1H} de 3,2 mm.La temperatura de la mostra es va controlar mitjançant un corrent de gas de temperatura variable a 277 K. Els espectres de ressonància rotacional de dipol bidimensional (DARR)76 i de reconnexió de radiofreqüència (RFDR)77 es van adquirir a freqüències MAS de 12,5 kHz i 20 kHz, respectivament.La polarització creuada (CP) d'1H a 13C es va realitzar mitjançant una rampa lineal de 60,0 a 48,0 kHz a 1H, 61,3/71,6 kHz a 13C (a 12,5/20 kHz MAS) i temps de contacte 0,5-1 ms.Durant la recollida de dades es va utilitzar el desacoblament Spinal6478 a 73,5 kHz.El temps d'adquisició va ser de 10 mil·lisegons i el retard del cicle va ser de 2,5 segons.Les correlacions Cα/Cβ d'un sol enllaç observades als espectres RFDR es van assignar en funció dels canvis químics característics del tipus de residu i les correlacions multienllaçades en els espectres DARR.
La base de dades Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) es va utilitzar per avaluar les tendències de flutter i l'energia Rosetta per a NT, NTFlSp i NTMiSp.La base de dades Zipper calcula Rosetta Energy80, que combina diverses funcions d'energia lliure per modelar i analitzar l'estructura de proteïnes.Un nivell d'energia de -23 kcal/mol o inferior indica una alta tendència a fibril·lar.La menor energia significa més estabilitat de les dues cadenes β a la conformació de la cremallera.A més, es va utilitzar l'algoritme Waltz per predir regions amiloidogèniques a NT, NTFlSp i NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
La solució de proteïna NT es va barrejar amb tampó d'àcid 2-(N-morfolino)etansulfònic (MES) a pH 5, 5 i 6, 0 per reduir el pH a pH 6 i 7, respectivament.La concentració final de proteïna va ser de 100 mg/ml.
Les mesures es van realitzar en un espectròmetre CD J-1500 (JASCO, EUA) amb una cubeta de 300 μL amb un camí òptic de 0,1 cm.Les proteïnes es van diluir a 10 μM (n = 1) en tampó fosfat de 20 mM (pH 8).Per analitzar l'estabilitat de les proteïnes en presència de sal, es van analitzar les proteïnes a la mateixa concentració (n = 1) en tampó de fosfat 20 mM (pH 8) que contenia 154 mM de NaF o NaCl, respectivament.Les exploracions de temperatura es van registrar a 222 nm de 25 °C a 95 °C amb una velocitat d'escalfament d'1 °C/min.La proporció de proteïnes plegades de forma nativa es va calcular mitjançant la fórmula (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).A més, es van registrar cinc espectres per a cada mostra de 260 nm a 190 nm a 25 °C i després d'escalfar a 95 °C.Es van promediar cinc espectres, es van suavitzar i es van convertir en el·lipticitat molar.Les dades es van analitzar amb Prism 9.
La intensitat de fluorescència de His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) es va mesurar per triplicat (n = 3) en plaques Corning de 96 pous amb un fons transparent negre (Corning Glass 3881, EUA) en condicions estàtiques.Mesureu mostres amb un lector de plaques basat en fluorescència amb una longitud d'ona d'excitació de 395 nm i registreu l'emissió a 509 nm abans de la gelificació i 2 hores després a 37 °C.Les dades es van analitzar amb Prism 9.
Es va utilitzar el kit d'assaig d'activitat de la fosforilasa de nucleòsids de purina (mètode fluoromètric, Sigma Aldrich) segons les instruccions del fabricant.Per mesurar l'activitat en gels i solucions que contenen His-NT-PNP, barregeu 10 ng de His-NT-PNP amb 100 mg/ml de NT fins a un volum total de 2 µL perquè el gel donava un senyal per sobre de l'interval de detecció del conjunt.Es van incloure controls per a gels i solucions sense His-NT-PNP.Les mesures es van realitzar dues vegades (n = 2).Després de mesurar l'activitat, es va eliminar la barreja de reacció i es va fotografiar el gel per assegurar-se que el gel es mantingués intacte durant la mesura.Les dades es van analitzar amb Prism 9.
Per obtenir més informació sobre el disseny de l'estudi, consulteu el resum de l'estudi Nature enllaçat a aquest article.
Les figures 1 i 2 presenten les dades inicials.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f i 6, Figs suplementàries.3, fig suplementària.5a, d, fig suplementària.6 i fig suplementària.8. Dades Les dades d'aquest estudi estan allotjades a la base de dades Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Les dades de RMN obtingudes en aquest estudi es van publicar al repositori BMRBig amb l'ID d'entrada bmrbig36.Les estructures de GFP i PNP es van extreure de PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. i Johansson, J. Spinning artificial spider silk.Química Nacional.biologia.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.El genoma de Nephila clavipes destaca la diversitat de gens de la seda d'aranya i la seva complexa expressió.Genette Nacional.49, 895–903 (2017).